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染色質免疫共沉淀(ChIP)

來源:西安昊興生物科技有限公司   2021年07月27日 10:38  

染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質-DNA復合物,并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA 相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態(tài)作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且,ChIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍:ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;ChIP與體內足跡法相結合,用于尋找反式因子的體內結合位點;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調控中的作用。由此可見,隨著ChIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

實驗流程:

甲醛處理細胞→收集細胞,超聲破碎→加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合→加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,并沉淀→對沉淀下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合→洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物→解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷→PCR分析。

具體操作:

第一天:

一、細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

取出細胞,加入甲醛,使得甲醛的終濃度為1%

37℃孵育10min。

終止交聯(lián)。

吸盡培養(yǎng)基,用冰冷的PBS清洗細胞2次。

細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中。預冷后離心收集細胞。

倒去上清。

超聲破碎。

二、除雜及抗體孵育

超聲破碎結束后,離心去除不溶物質。

100μl的超聲破碎產(chǎn)物中,加入900μl ChIP Dilution Bufer 20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉混勻1h。

1h后,在4℃靜置10min沉淀,700rpm離心1min。

取上清。各留取20μl做為input。一管中加入1μl抗體,另一管中則不加抗體。4°C顛轉過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果

100μl超聲破碎后產(chǎn)物,加入4μl 5M NaCl65℃處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。

電泳檢測超聲效果。

第二天:

免疫復合物的沉淀及清洗

孵育過夜后,每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA4℃顛轉2h。

4℃靜置10min后,離心除去上清。

清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,在4℃顛轉10min,4℃靜置10min沉淀,700rpm離心1min,

除去上清。

清洗完畢后,開始洗脫。

解交聯(lián):每管中加入20μl 5M NaClNaCl終濃度為0.2M)。混勻,65℃解交聯(lián)過夜。

第三天:

一、DNA樣品的回收

解交聯(lián)結束后,每管加入1μl RNAaseA(MBI) ,37℃孵育1h

每管加入10μl 0.5M EDTA,20μl 1M Tris.HClpH6.5),2μl 10mg/ml蛋白酶K。45℃處理2h

DNA片段的回收-omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100μl ddH2O

二、PCR分析。

技術結合

CHIP-seq的原理是:首先通過染色質免疫共沉淀技術(ChIP)特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,并對其進行純化與文庫構建;然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上,從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等相互作用的DNA區(qū)段信息。

染色質免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip):ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選。ChIP-chip 技術的發(fā)展為分析活細胞或組織中DNA與蛋白質的相互關系提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中,將對芯片的構建進行改進,提高其實用性。使用易于獲得的抗體,增加這種方法的可用性。

技術應用

染色質免疫共沉淀技術主要應用于:組蛋白的修飾研究;染色質表觀遺傳修飾研究;轉錄調控分析;藥物開發(fā)研究;有絲分裂研究;DNA損傷與凋亡分析等。

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