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藥物疫苗中蛋白檢測的TN分析法

來源:德國耶拿分析儀器有限公司   2021年07月27日 15:11  

背景介紹

在藥物疫苗生產(chǎn)中,需要對起始、中間和最終產(chǎn)品的抗原水平進行控制。用以檢測衰減失活的病毒或細菌數(shù)量。由于這些抗原通常由蛋白質(zhì)組成,總蛋白的分析定量是一種可選方法。

《藥典》規(guī)定了許多相關(guān)方法,其中包括幾種紫外/可見分光光度法(如Lowry法、Bradford法、BCA法)以及兩種總氮法,即凱氏定氮法和催化燃燒法。本應用說明重點介紹了歐洲藥典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃燒法氮化合物在氧氣中高溫裂解為一氧化氮(NO),然后通過化學發(fā)光檢測器(CLD)進行檢測。此方法描述幾乎與EN 12260一致,后者描述了環(huán)境水中TNb的測定。 multi N/C分析儀既是如此設(shè)計,因此也可用于醫(yī)藥產(chǎn)品中TNb的測定。TNb可以轉(zhuǎn)化為總蛋白來確定抗原的水平。

由于蛋白質(zhì)的含氮量不同,根據(jù)以下公式乘以系數(shù)6.25,將總氮濃度轉(zhuǎn)換為總蛋白質(zhì)濃度已被廣泛接受:

C [總蛋白] = c [TN] x 6.25  

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儀器

1: 分析儀說明:multi N/C 2100S

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樣品和試劑

在客戶現(xiàn)場制備的5個尿素TNb校準標準1個BSA對照標準品和3個未知客戶樣品,測定三次。分析前,樣品在4下制冷劑中保存。

恢復至室溫室后,用微量移液管將液體樣品直接轉(zhuǎn)移到2毫升樣品瓶中,并蓋上瓶蓋。自動進樣器取樣75μL樣品直接注射進燃燒爐中。在鉑催化劑的作用下,所有氮化合物在純氧環(huán)境中通過高溫燃燒催化轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO隨后化學發(fā)光檢測器(CLD)定量檢測NO。

測樣順序、自動攪拌及洗針設(shè)置均由AS60自動進樣器控制完成。

 


校正

BSA蛋白質(zhì)標準溶液配置5  60 mg/L系列總氮(TNb)多點校準標樣。200mg TN/L BSA儲備溶液(Sigma Art.Nr. A-7906,白蛋白,牛含量為15.60%,純度為98%),128.2mg,用超純水定容至100mL。此類樣品中從測定的氮含量計算蛋白質(zhì)濃度的標準轉(zhuǎn)換因子(在文獻中找到)6.25


校正曲線

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1:TN示例  BSA校正曲線和特征范圍5-60mg/L N


結(jié)果和討論

每個樣品至少測定三次。


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結(jié)論

所有樣品都得到了很好的重復性,RSD值很低。

采用微量注射器進樣,從樣品瓶到燃燒爐的距離短,直接注射無傳輸管路和閥門。樣品消耗量極少,3次潤洗,5次75μL重復測試,樣品消耗總體積不超過1.5mL。

配置CLD檢測器的multi N/C分析儀是進行總氮測定的最佳分析系統(tǒng),遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B??蛻舻男蕵藴势泛蜋z查標準(BSA)的回收率佳,樣品峰型多次測量均無偏移重復性好,且無拖尾,充分證明了儀器性能。

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