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藥物疫苗中蛋白檢測(cè)的TN分析法

來(lái)源:德國(guó)耶拿分析儀器有限公司   2021年07月27日 15:11  

背景介紹

在藥物疫苗生產(chǎn)中,需要對(duì)起始、中間和最終產(chǎn)品的抗原水平進(jìn)行控制。用以檢測(cè)衰減失活的病毒或細(xì)菌數(shù)量。由于這些抗原通常由蛋白質(zhì)組成,總蛋白的分析定量是一種可選方法。

《藥典》規(guī)定了許多相關(guān)方法,其中包括幾種紫外/可見(jiàn)分光光度法(如Lowry法、Bradford法、BCA法)以及兩種總氮法,即凱氏定氮法和催化燃燒法。本應(yīng)用說(shuō)明重點(diǎn)介紹了歐洲藥典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃燒法氮化合物在氧氣中高溫裂解為一氧化氮(NO),然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CLD)進(jìn)行檢測(cè)。此方法描述幾乎與EN 12260一致,后者描述了環(huán)境水中TNb的測(cè)定。 multi N/C分析儀既是如此設(shè)計(jì),因此也可用于醫(yī)藥產(chǎn)品中TNb的測(cè)定。TNb可以轉(zhuǎn)化為總蛋白來(lái)確定抗原的水平。

由于蛋白質(zhì)的含氮量不同,根據(jù)以下公式乘以系數(shù)6.25,將總氮濃度轉(zhuǎn)換為總蛋白質(zhì)濃度已被廣泛接受:

C [總蛋白] = c [TN] x 6.25  

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儀器

1: 分析儀說(shuō)明:multi N/C 2100S

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樣品和試劑

在客戶現(xiàn)場(chǎng)制備的5個(gè)尿素TNb校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)、1個(gè)BSA對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和3個(gè)未知客戶樣品,測(cè)定三次。分析前,樣品在4下制冷劑中保存。

恢復(fù)至室溫室后,用微量移液管將液體樣品直接轉(zhuǎn)移到2毫升樣品瓶中,并蓋上瓶蓋。自動(dòng)進(jìn)樣器取樣75μL樣品直接注射進(jìn)燃燒爐中。在鉑催化劑的作用下,所有氮化合物在純氧環(huán)境中通過(guò)高溫燃燒催化轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO,隨后化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CLD)定量檢測(cè)NO。

測(cè)樣順序、自動(dòng)攪拌及洗針設(shè)置均由AS60自動(dòng)進(jìn)樣器控制完成。

 


校正

BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配置5  60 mg/L系列總氮(TNb)多點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)樣。200mg TN/L BSA儲(chǔ)備溶液(Sigma Art.Nr. A-7906,白蛋白,牛含量為15.60%,純度為98%),128.2mg,用超純水定容至100mL。此類樣品中從測(cè)定的氮含量計(jì)算蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換因子(在文獻(xiàn)中找到)6.25。


校正曲線

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1:TN示例  BSA校正曲線和特征范圍5-60mg/L N


結(jié)果和討論

每個(gè)樣品至少測(cè)定三次。


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結(jié)論

所有樣品都得到了很好的重復(fù)性,RSD值很低。

采用微量注射器進(jìn)樣,從樣品瓶到燃燒爐的距離短,直接注射無(wú)傳輸管路和閥門。樣品消耗量極少,3次潤(rùn)洗,5次75μL重復(fù)測(cè)試,樣品消耗總體積不超過(guò)1.5mL。

配置CLD檢測(cè)器的multi N/C分析儀是進(jìn)行總氮測(cè)定的最佳分析系統(tǒng),遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B??蛻舻男?zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和檢查標(biāo)準(zhǔn)(BSA)的回收率佳,樣品峰型多次測(cè)量均無(wú)偏移重復(fù)性好,且無(wú)拖尾,充分證明了儀器性能。

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