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干貨分享--WB實驗問題總結與處理方案(二)

來源:西安昊興生物科技有限公司   2021年07月27日 15:16  

Western blot實驗過程中常見問題匯總及處理方案。

 

21、想分離的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?濃縮膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?

答:分離膠用7%,濃縮膠 3.5%,200kd的蛋白不好做。

 

22、如果上樣量超載,要用什么方法來增加上樣量?

答:可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的。

 

23、蛋白變性后可以存放多久?

答:-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)

 

24、我所測定的蛋白分子量是105KD,按理說分離膠應當采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?

答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內,但需注意條帶位置。

 

25、二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,是嗎?

答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應該好一點.

 

26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?

答:Western Blot一般上樣30100ug不等,結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。開始摸條件時,為了拿到陽性結果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當然背景也就出來了。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復地試了,當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。

 

27、做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品?

答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。

 

28、問大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

答:做200kd蛋白的Western Blot時要注意,分離膠最好選擇7%的;剝膠時要小心;轉移時間需要相應延長;要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析)。

 

29、有什么方法可以提高上樣量?

答:a)可以濃縮樣品;增大上樣體積來增大上樣量;b)5倍的上樣緩沖液來稀釋變性

 

30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求?

答:上樣量要根據(jù)實驗的要求來定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關系, 盡量多上就行了, 但是不要超載。

 

31、一抗,二抗的比例是否重要?

答:比較重要,調整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底。

 

32、要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

答:對二抗無要求,要看你實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。

 

33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?

答:免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。

 

34、Western Blot 中抗體的可以重復應用嗎?

答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用23次。稀釋后應在23天內使用,4度保存,避免反復凍融。

 

35、在做Western Blot時,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

 

36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎?

答:可以。

 

37、轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶,為什么大蛋白分子的一端的轉膜好象不是很好,為什么?

答:這是正常的,大分子的蛋白轉移的慢, 你延長轉移時間和電流,大分子一端就會好的多,但是小分子的就有可能會變淡。

 

38、做Western Blot時,同樣的抗體免疫組化能做出,而Western Blot卻不能?

答:這多半是抗體的問題,要看抗體的說明,是否能做Western Blot和免疫組化。

 

39、如果是6×8轉印膜,要加多少一抗?

答:一抗的稀釋度是有說明的,根據(jù)你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。

 

40、上下槽緩沖液有何要求,怎樣才能達到最佳效果。

答:無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液,下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。

 


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