摘要：本文介紹了利用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜系統(tǒng)、Agilent 1290 Infinity Ⅱ ELSD 檢測器和 Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm 色譜柱對 PEG 偶聯(lián) 重組蛋白注射劑中的吐溫 20 進(jìn)行定量分析的簡單靈敏的方法。該方法采用含三氟yi酸 (0.1% TFA) 的乙腈和水溶液為流動相，以梯度條件對注射劑中吐溫 20 進(jìn)行分離分析。該 方法操作方便，靈敏度高，具有良好的線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度，為生物制藥企業(yè)測定 PEG 偶聯(lián)的一類重組蛋白制劑中的吐溫 20 輔料提供一種可選的解決方案。

前言：隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，生物制劑研究著重應(yīng)用于多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細(xì)胞 生長因子及單克隆抗體等領(lǐng)域。但是由于生物大分子具有天然的不穩(wěn)定性，因此通常將吐 溫等藥用輔料添加到制劑中，以保證生物制劑的穩(wěn)定性和安全性。

吐溫 20（聚山梨酯 20，Tween 20）是一種非離子表面活性劑， 具有較強(qiáng)的親水性和化學(xué)穩(wěn)定性，對藥物有較好的助溶作用，添 加到藥物制劑中可提高其有效成分的溶解度。同時，吐溫 20 能 夠抑制大分子蛋白藥物的自動聚合，提高蛋白藥物的穩(wěn)定性。 目前文獻(xiàn)報道的吐溫分析方法比較多，包括 HPLC-ELSD[1-2]、 HPLC-DAD[3]、HPLC-CAD[4] 和 LCMS[5] 等方法。在實際蛋白制劑中 的吐溫分析中，這些分析方法由于受到不同蛋白藥物的影響，各 有其優(yōu)缺點。 本文建立了一種分析吐溫 20 的 RP-HPLC-ELSD 方法，該方法在 直接進(jìn)樣 PEG 偶聯(lián)的蛋白注射劑后，即可對其中的輔料吐溫 20 進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

實驗部分：試劑和樣品 吐溫 20 購自南京威爾藥業(yè)股份有限公司（注射級）；聚乙二醇 (PEG，MW20000) 購自 JenKem Technology。三氟yi酸 (TFA) 為 HPLC 級，購自 DikmaPure 公司；乙腈為 HPLC 級，購自 J.T. Baker 公司（美國）。高純水來自 Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國）現(xiàn) 制備。 含吐溫 20 的 PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑、不含吐溫 20 的陰性樣品 和不含吐溫 20 的空白輔料（含 PEG 等其它輔料）均由生物制藥 廠家提供。 儀器和設(shè)備 采用最高耐壓達(dá) 800 bar 的 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜 系統(tǒng)，由以下模塊組成： – Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump 四元梯度泵（部件號 G7104C） – Agilent 1260 Infinity II Multisampler 自動進(jìn)樣器（部件號 G7167A） – Agilent 1260 Infinity MCT 柱溫箱（部件號 G7116A） – Agilent 1290 Infinity II ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器（部件號 G7102A） 利用 Agilent OpenLab CDS 2.4 軟件進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)分析。

RP-HPLC 色譜條件 色譜柱： Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm，部件號 683975-302 (T) 柱溫： 50 °C 進(jìn)樣量： 10 μL 流速： 0.5 mL/min 檢測器： ELSD 霧化溫度： 50 °C 蒸發(fā)溫度： 70 °C 氣體流速： 1.80 SLM 流動相 A： 0.1% TFA 的水溶液 流動相 B： 0.08% TFA 的乙腈溶液 梯度程序： 時間 (min) B (%) 0 5 5 5 6 60 10 80 15 80 15.1 5 20 5 柱后閥切換： 0–7.5 min：1-2，至廢液 7.5–9.5 min：1-6，至 ELSD 9.5–20 min：1-2，至廢液

校準(zhǔn)曲線繪制 利用濃度范圍為 10–200 μg/mL 的 5 個吐溫 20 校準(zhǔn)標(biāo)樣，對各濃 度下的平均峰面積對分析物濃度作圖，得到校準(zhǔn)曲線。 樣品前處理 方法一：取待測樣品溶液（空白輔料、陰性樣品或蛋白注射劑）， 過 0.22 μm 有機(jī)濾膜，直接進(jìn)樣分析。 方法二：取 1.0 mL 待測樣品溶液到離心管中，加入 1.0 mL 乙腈 并混勻；靜置一段時間后進(jìn)行高速離心（13200 r/min，5 min）； 然后取上清液，過 0.22 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)樣分析。

結(jié)果與討論：吐溫 20 的 RP-LC 分析 比較了不同分離模式（SEC 和 RP）對 PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑 中吐溫 20 的分離結(jié)果。 SEC 是分離蛋白溶液中輔料的常見方法。本實驗中的蛋白分子 量比較?。?9 kDa，PEG 修飾后為 39 kDa)，選擇孔徑為 130 ? 的色譜柱，并以乙腈和甲酸銨為流動相進(jìn)行分析。吐溫 20 在此 SEC 條件下色譜峰比較寬，靈敏度不高，且會受到前面蛋白色譜 峰和后面緩沖鹽色譜峰的影響