—想變哪里變哪里

定點突變技術(shù)是利用PCR等技術(shù)定向改變基因的特定堿基序列，是研究基因功能和蛋白功能的一種非常有用的手段。通過該技術(shù)，可迅速，高效提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，從而來闡明目的基因的調(diào)控機理，以及下游實驗中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

翌圣生物推出的全新定點突變試劑盒基于Hieff Clone® 快速克隆技術(shù)的定點突變系統(tǒng)，目標質(zhì)粒擴增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化、Hieff Clone^®重組環(huán)化后直接進行轉(zhuǎn)化即可完成定點突變。高效快速的實現(xiàn)直接對目標質(zhì)粒中的靶位點進行單點突變，多點突變，以及插入或缺失等。

? 應(yīng)用范圍廣：可進行單點，多點突變

? 擴增性能*：超高保真酶可擴增長度小于20kb的任何質(zhì)粒

? 高效DpnI酶：可充分有效降解未突變的質(zhì)粒模板

? 引物設(shè)計與目標質(zhì)粒擴增

反向PCR引物中需引入同源臂和突變位點。

? DpnI 消化質(zhì)粒模板

質(zhì)粒模板來源于大腸桿菌，為dam甲基化修飾，對DpnI敏感而被切碎。反向PCR合成的帶突變位點的線性化質(zhì)粒因沒有甲基化而不被切開。

? 重組反應(yīng)

同源臂在重組酶的作用下進行重組。

圖1. 進行單堿基（或多堿基）定點突變實驗流程

[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF37.205）

[2]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.（IF31.398）

[3]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. （IF31.398）

[4]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158.（IF 20.46）  

[5]. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7.（IF14.548）

[6]. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019.（IF14.548）

Q1. 請問單點突變/多點突變是否都是每個位點設(shè)計一對引物？是否都包括堿基/氨基酸突變，堿基插入和缺失？堿基插入/缺失的最大長度是多少?是否可以進行連續(xù)氨基酸的突變，氨基酸的數(shù)量限制是多少？

A1：單點突變/多點突變是每個位點設(shè)計一對引物；正反向引物可以包括堿基/氨基酸突變，堿基插入和缺失，也可以將這些放在一條引物上；堿基插入/缺失的最大長度沒有限制，可為任何長度；可以進行連續(xù)氨基酸的突變，無特別數(shù)量限制。

Q2. 引物設(shè)計的原則是什么？有無引物設(shè)計軟件，若沒有，推薦幾個好用的引物設(shè)計軟件。

A2：引物設(shè)計基本原則是使擴增產(chǎn)物末端有同源序列即可。無*設(shè)計軟件，推薦軟件Primer5，Vector NTI。

Q3. 本試劑盒可以進行多點突變，能夠同時進行幾個位點的突變? 突變效率如何?進行單點突變的突變效率是多少？

A3：最高同時突變6個獨立位點（每個位點之間相距超過100bp）。突變效率非常高（單次反應(yīng)500多個克隆，陽性率超過95%）。

Q4. 該kit不含有感受態(tài)細胞，推薦的感受態(tài)細胞是哪些？
A4：Top十、DH5α、JM109等常規(guī)感受態(tài)。