——看ChIP-Seq的進(jìn)化形態(tài)如何玩轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)!

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變。表觀遺傳調(diào)控是指基因的表達(dá)水平受各種修飾的影響，其分子基礎(chǔ)有兩個(gè)方面，即針對(duì)DNA本身的修飾和對(duì)組蛋白的修飾。蛋白質(zhì)與DNA相互作用是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵，也是基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的前提。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)DNA互作研究常用的有凝膠阻滯，酵母雜交，ChIP-Seq等，其中ChIP-Seq可以完整的反映與靶蛋白結(jié)合的DNA序列，是蛋白質(zhì)與DNA互作的經(jīng)典方法。

但是近年來(lái)CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagment）作為一種新興的DNA蛋白互作研究技術(shù)，憑借其信噪比高，可重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)周期更快等優(yōu)勢(shì)，在植物以及動(dòng)物細(xì)胞中的成功應(yīng)用，相關(guān)科研成果也陸續(xù)發(fā)表^[1-2]，受到廣大科研工作者的信賴。

2009年，Dominic Schmidt等將ChIp與當(dāng)時(shí)熱門技術(shù)NGS結(jié)合，成就了ChIP-Seq技術(shù)，從而能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與蛋白相互作用的DNA區(qū)域。

1.ChIP-Seq

1） 實(shí)驗(yàn)原理

甲醛處理細(xì)胞使目標(biāo)蛋白與DNA交聯(lián)，通過(guò)超聲波將交聯(lián)后的染色質(zhì)打斷成小片段，一般在200-600 bp范圍內(nèi)，再利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，純化之后進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建并測(cè)序。

2）實(shí)驗(yàn)流程

圖1. ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)流程

3）實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)

?  時(shí)間長(zhǎng)，一次實(shí)驗(yàn)需要2~3天，且操作誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大；

? 起始的細(xì)胞需求量大，需要10⁷個(gè)細(xì)胞，且背景噪音較高；

? 甲醛交聯(lián)與免疫共沉淀需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)控制時(shí)間，會(huì)造成非特異結(jié)合增加；

? 對(duì)抗體的特異性要求高，需要ChIP級(jí)別的抗體。

2019年，Henikoff實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了CUT&Tag，使用ProteinA/G-Tn5從而簡(jiǎn)化了二代測(cè)序的步驟，并且極大降低了細(xì)胞的起始數(shù)量。

2.CUT&Tag

1）實(shí)驗(yàn)原理

CUT&Tag是蛋白質(zhì)與DNA互作的革新技術(shù)，無(wú)需通過(guò)甲醛交聯(lián)以及免疫共沉淀，其核心技術(shù)為pA/G-Tn5 Transposase，將Protein A/G與Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行融合，使得與抗體結(jié)合的同時(shí)，Tn5切割核小體上纏繞的DNA片段，獲得目的序列。

圖2. CUT&Tag原理圖

2）實(shí)驗(yàn)流程

利用連有刀豆蛋白A的磁珠（ConA）結(jié)合細(xì)胞（與細(xì)胞膜上的糖蛋白結(jié)合）并利用洋地黃皂苷進(jìn)行細(xì)胞膜通透，接著孵育靶蛋白的抗體，二抗以及Protein A/G Tn5?？贵w和Protein A/G與Tn5能夠進(jìn)入細(xì)胞核，Tn5此時(shí)在Protein A/G的幫助下切割靶蛋白附近的DNA序列，由于Tn5是經(jīng)過(guò)修飾的，切割的同時(shí)會(huì)在片段的兩端加上一部分Adapter序列，再通過(guò)PCR文庫(kù)擴(kuò)增可得到對(duì)應(yīng)的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

圖3. CUT&Tag實(shí)驗(yàn)流程

3）技術(shù)優(yōu)勢(shì)

? 流程簡(jiǎn)便：無(wú)需甲醛交聯(lián)、超聲打斷、免疫共沉淀，無(wú)需補(bǔ)平，加A和接頭；

? 可視化操作：利用ConA beads結(jié)合細(xì)胞，操作可視化；

? 磁珠回收：片段化后DNA磁珠回收基因組DNA，簡(jiǎn)化操作，減少雜質(zhì)引入；

? 特異性好：抗體與靶蛋白特異性結(jié)合進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域定位；

? 起始量低：所需細(xì)胞數(shù)10^7下降到10^2，甚至可以做單細(xì)胞水平研究；

? 性價(jià)比高：無(wú)需ChIP級(jí)別抗體，背景噪音低，所需測(cè)序深度少；

? 重復(fù)性好：實(shí)驗(yàn)重復(fù)結(jié)果一致性好。

Henikoff等通過(guò)三種方法來(lái)對(duì)組蛋白H3K27me3進(jìn)行研究，在相同的數(shù)據(jù)量（8M Reads）情況下，三種方法的染色體景觀相似，但ChIP-Seq的背景較高，CUT&Tag的信號(hào)更強(qiáng)，信噪比更高。

圖4.  CUT&Tag、CUT&RUN（Henikoff于2017年發(fā)明了新技術(shù)）的peaks鑒定結(jié)果與ChIP-Seq的對(duì)比(Henikoff,2019)

同時(shí)CUT&Tag可以對(duì)極少量細(xì)胞（60個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行操作，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序。Protein A-Tn5在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核酸切割，PCR之前的反應(yīng)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。Henikoff博士通過(guò)分配單個(gè)細(xì)胞到5184納米孔，再加入帶隨機(jī)標(biāo)簽的引物進(jìn)行擴(kuò)增的辦法，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序。

圖5. 單細(xì)胞CUT&Tag測(cè)序流程(Henikoff,2019)

翌圣生物CUT&Tag試劑盒相較于傳統(tǒng)的ChIP-seq，優(yōu)化了反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)操作流程，文庫(kù)時(shí)間更短（僅需7小時(shí)），起始樣本要求更低，抗體投入量更少，文庫(kù)產(chǎn)量更高等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)-DNA互作研究技術(shù)的又一創(chuàng)新。

1.更高的文庫(kù)質(zhì)量。

圖6. 文庫(kù)質(zhì)檢圖

2.更優(yōu)異的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

圖7.測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)比圖

3.更高的信噪比

圖8.信噪比展示

[1]. Dan Lu, Liu L, Sun Y, Song J, Yin Q, Zhang G, Qi F, Hu Z, Yang Z, Zhou Z, Hu Y, Zhang L, Ji J, Zhao X, Jin Y, McNutt MA, Yin Y. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity. Nat Immunol. 2020 Mar;21(3):287-297. doi: 10.1038/s41590-019-0577-9. Epub 2020 Jan 13. PMID: 31932812.

[2]. Tao X, Feng S, Zhao T, Guan X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 2020 Aug 31;16:120. doi: 10.1186/s13007-020-00664-8. PMID: 32884577; PMCID: PMC7460760.

[3]. Kaya-Okur, H. S., Wu, S. J., Codomo, C. A., Pledger, E. S., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., ... & Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications, 10(1), 1930.

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