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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：1.1提取高品質(zhì)RNA
RNA提取是RT-qPCR實驗成功的首要步驟，RNA的質(zhì)量直接關(guān)乎RT-qPCR實驗的結(jié)果。但是在實驗過程中我們經(jīng)常會碰到RNA提取實驗翻車的情況，主要是因為RNA的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和無處不在的RNase對RNA的降解造成的。
由此可見，想要提取到高質(zhì)量的RNA并非易事。今天，小翌主要從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個方面來闡述RNA提取過程需注意的關(guān)鍵要點，以輔助后續(xù)的qPCR實驗順利進行。
樣本的選擇
樣本最好選擇處于生長旺盛期的新鮮細胞，新鮮、生長旺盛的動物組織，新鮮幼嫩的植物組織。
樣本采集和保存
注：Trizol為裂解液，可用于保存細胞，但不適用于組織樣本保存。當(dāng)細胞存放在Trizol中需注明每管的細胞數(shù)量。
其他Tips
常見的RNA提取方法
1. 沉淀法
? 原理
Trizol中含有苯酚、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，可裂解樣本釋放核酸，并抑制RNase活性。加入氯仿離心分層，收集上清，經(jīng)異丙醇沉淀得到總RNA
Trieasy (貨號：10606)
2. 離心柱法
? 原理
高鹽吸附、低鹽洗脫
? 特點
培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒(貨號：19231）
組織/細胞RNA提取試劑盒（貨號：19221）
多糖多酚植物RNA提取試劑盒（貨號：19292）
在此，給大家介紹一款11min即可完成培養(yǎng)細胞RNA提取的的柱式提取試劑盒：培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（19231）。
? 產(chǎn)品特點：
? 案例展示：
使用培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（19231）和O品牌常規(guī)細胞/組織RNA提取試劑盒各提取2份293T細胞（10^6個細胞）的總RNA。結(jié)果顯示，該試劑盒提取到的目標(biāo)RNA產(chǎn)量一致，但純度更高，如表1和圖2。
表1. Nanodrop測定RNA濃度
備注：Y1，Y2代表培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（19231）；O1，O2代表O品牌常規(guī)細胞/組織RNA提取試劑盒
▲ 圖2a.hGAPDH擴增結(jié)果
▲ 圖2b.hBC6擴增結(jié)果
圖2. 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒的定量結(jié)果與O品牌基本一致。取1 μL洗脫液反轉(zhuǎn)錄，以cDNA的10倍稀釋液為模板，定量測試 hGAPDH 和 hBC6 2個基因
綜上，小翌從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個方面闡述了提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵要點，下期小翌將講解RNA質(zhì)量評估以及RNA降解對qPCR實驗結(jié)果的影響等方面的內(nèi)容，我們下期不見不散~
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