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拿來吧你,拯救你的重組蛋白

來源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2021年08月13日 16:18  

重組蛋白是應(yīng)用了重組DNA或重組RNA技術(shù)而獲得的蛋白質(zhì)。用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主細(xì)胞主要是細(xì)菌(大腸桿菌)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母。重組蛋白已被廣泛應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)研究、免疫檢測(cè)試劑、重組蛋白藥物、診斷試劑開發(fā)、抗體藥物靶點(diǎn)、CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)、Fc受體、流感病毒蛋白和細(xì)胞因子等大多數(shù)熱門研究領(lǐng)域。

那大家在進(jìn)行重組蛋白表達(dá)時(shí)不知道會(huì)不會(huì)糾結(jié)這些問題:該選擇什么表達(dá)系統(tǒng)?蛋白產(chǎn)量怎么才能有所提高?                      

接下來帶你們了解一些常見的外源基因表達(dá)系統(tǒng)(包括原核、真核表達(dá)系統(tǒng))以及一些提高蛋白產(chǎn)量的方法。


原核表達(dá)系統(tǒng)(主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)),真核表達(dá)系統(tǒng)(主要包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),酵母表達(dá)系統(tǒng),昆蟲表達(dá)系統(tǒng))。


酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工能力,有利于真核蛋白的表達(dá),*的 AOX 強(qiáng)效啟動(dòng)子使得外源基因表達(dá)量很高,而且酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物,非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),另外用甲醇代替 IPTG 作為誘導(dǎo)物,部分甲醇酵母以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物代替葡萄糖作為碳源,生產(chǎn)成本非常低。


但是酵母在表達(dá)外源基因時(shí)會(huì)造成產(chǎn)物蛋白的不均一、降解、信號(hào)肽加工不*、多聚體形成等問題。


桿狀病毒做為外源基因表達(dá)的宿主,由于其可以對(duì)真核蛋白進(jìn)行翻譯后加工等過程而被廣泛地用于真核基因的體外表達(dá)。

體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。其中原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌表達(dá)為主,也是目前應(yīng)用*泛最多的表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)系統(tǒng)分為:哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá),酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。


真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)各自優(yōu)缺點(diǎn):



其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)又分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)和穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建,重組抗體生產(chǎn)。酵母系統(tǒng)又分為畢赤酵母表達(dá)和釀酒酵母表達(dá)。針對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)來說,哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母表達(dá)較為常用。


雖然桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)δ康牡鞍鬃龇g后修飾,但這種修飾存在著一定的限度; 雖然其糖基化位點(diǎn)與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一樣,但寡糖鏈的性質(zhì)有所不同,無法產(chǎn)生復(fù)雜的糖基側(cè)鏈,這可能是由于昆蟲細(xì)胞不能將成熟糖鏈加工成哺乳動(dòng)物細(xì)胞中類似的形式。


哺乳動(dòng)物細(xì)胞自身具備蛋白折疊和翻譯后修飾的功能,其表達(dá)的重組蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面zui接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子,更有可能獲得與天然分子相同的生物活性。





提高大腸桿菌可溶性重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率可以從啟動(dòng)子的選擇、SD序列的引入、信號(hào)肽的優(yōu)化、宿主細(xì)胞的選擇、共表達(dá)其他蛋白質(zhì)、高密度發(fā)酵等方面著手。



啟動(dòng)子及其他載體元件能夠顯著影響目的基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度與持續(xù)性,進(jìn)而影響目的蛋白產(chǎn)率。合適的啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)具有以下三個(gè)特征:①能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的高效表達(dá)(通常使目的蛋白占菌體總蛋白質(zhì)的10% ~50%) ;②減少本底表達(dá),防止本底表達(dá)的目的蛋白對(duì)宿主對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期造成負(fù)面影響;③誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。


SD序列可以減少 mRNA 形成,能夠降低翻譯效率,因此對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物,有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯是必需的。


大腸桿菌周質(zhì)空間中蛋白質(zhì)的種類少、數(shù)量低,且蛋白酶含量也較低,因此目的蛋白在周質(zhì)空間中的表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白酶的降解。


目的蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間過程中信號(hào)肽被酶切,且氧化性的周質(zhì)空間有助于目的蛋白的正確折疊與正確構(gòu)象的維持。具有不同特性的工程菌對(duì)重組蛋白的可溶性表達(dá)具有重要意義,目前已有多種商品化的大腸桿菌株能夠協(xié)助重組蛋白的可溶性表達(dá)。


具有不同特性的工程菌對(duì)重組蛋白的可溶性表達(dá)具有重要意義,目前已有多種商品化的大腸桿菌株能夠協(xié)助重組蛋白的可溶性表達(dá)。


哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)主要通過調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)的參數(shù)(比如pH、C02濃度、離子強(qiáng)度和細(xì)胞密度,培養(yǎng)基等)和利用基因工程的方法(通過在表達(dá)載體上插入強(qiáng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子來增加轉(zhuǎn)錄水平)提高蛋白表達(dá)量。



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