單細(xì)胞測(cè)序，不是只有BD和10×Genomics
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)指的是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個(gè)單個(gè)細(xì)胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細(xì)胞間的細(xì)胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況。
單細(xì)胞測(cè)序發(fā)展的十余年，使得我們所認(rèn)知的這個(gè)世界越來(lái)越精準(zhǔn)。我們傳統(tǒng)的測(cè)序方法，是在組織水平或者說(shuō)多細(xì)胞水平上進(jìn)行的，最終得到的數(shù)據(jù)其實(shí)是從多個(gè)或者多類(lèi)細(xì)胞中得到的平均值，但是無(wú)法明確細(xì)胞異質(zhì)性的信息。而單細(xì)胞測(cè)序，則能夠在更精細(xì)的單個(gè)細(xì)胞水平上獲得遺傳信息，從而揭示每個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映常規(guī)測(cè)序所無(wú)法得到的異質(zhì)性信息和稀有細(xì)胞的遺傳信息。因此也有人稱(chēng)單細(xì)胞測(cè)序?yàn)镹GS的“顯微鏡”。
圖1. 單細(xì)胞測(cè)序發(fā)展歷程單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的難點(diǎn)單細(xì)胞測(cè)序最大的局限性在于待測(cè)核酸的含量，如一個(gè)細(xì)胞里的DNA或RNA含量?jī)H僅處在皮克 (picograms) 級(jí)水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到現(xiàn)有建庫(kù)試劑盒的低投入量需求。因此，必須先對(duì)單細(xì)胞內(nèi)的微量核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，而且必須保證盡可能少地出現(xiàn)技術(shù)誤差，以便開(kāi)展后續(xù)的測(cè)序及其它研究。其次高通量單細(xì)胞測(cè)序需要增加捕獲效率，提高靈敏度。除此之外，樣本處理過(guò)程中對(duì)于稀有樣本的獲取和難解離組織的細(xì)胞分離，也是很大的挑戰(zhàn)。主要的幾種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)
10×genomics 公司的 Chromium 系統(tǒng)，利用微流控技術(shù)將細(xì)胞自動(dòng)分配到 100,000到 1,000,000微反應(yīng)體系，每個(gè)微反應(yīng)體系含有一種特定的 barcode 序列；含有 barcode 信息的凝膠珠子（GEMs）首先與樣品和酶的混合物混合，然后與位于微流體「雙十字」連接中的油表面活性劑溶液結(jié)合；GEMs 流到儲(chǔ)液器中并進(jìn)行收集。凝膠珠子溶解釋放 barcode 序列，開(kāi)始對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記；最后將每個(gè)液滴中含有 barcode 信息的產(chǎn)物混合，然后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序文庫(kù)。
10×genomics的優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞通量高，建庫(kù)周期短，操作簡(jiǎn)便，具有超高的捕獲效率。不足之處在于只能獲得3’端的轉(zhuǎn)錄本信息，且樣本要求高。
圖2. 10×genomics測(cè)序原理
BD Rhapsody 技術(shù)利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標(biāo)記微球上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的分子標(biāo)簽，然后將這些微球合并到單個(gè)管中用于 cDNA 擴(kuò)增和文庫(kù)構(gòu)建?？蓾M(mǎn)足 100~10,000 個(gè)細(xì)胞的自動(dòng)分選、擴(kuò)增及建庫(kù)。此外，該技術(shù)使用帶有寡核苷酸的高質(zhì)量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細(xì)胞在經(jīng)過(guò) Ab-oligos 標(biāo)記后，可在單細(xì)胞水平同時(shí)獲得轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)。相比于10×genomics，BD Rhapsody在捕獲效率和有效性上有一定優(yōu)勢(shì)。
圖3. BD Rhapsody測(cè)序原理
◎ 基于PCR擴(kuò)增的Smart-seq技術(shù)
Smart-Seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一項(xiàng)具里程碑意義的技術(shù)。細(xì)胞被裂解后，將RNA與包含oligo(dT)的引物雜交。然后添加幾個(gè)無(wú)模板的C核苷酸，生成第一條鏈。這種poly(C)垂懸只添加到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本上。然后將寡核苷酸引物與poly(C)突出雜交，合成第二條鏈。全長(zhǎng)cDNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，以獲得納克級(jí)的DNA。PCR產(chǎn)物純化后可用于測(cè)序。在后來(lái)又有學(xué)者對(duì)該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，新方案使用鎖核酸（LNA）、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿。它不再需要純化步驟，可大大提高產(chǎn)量。Smart-seq相比較于10×genomics檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本更多，但是不足在于測(cè)序reads無(wú)法實(shí)現(xiàn)鏈特異性，同時(shí)由于對(duì)聚腺苷酸化的RNA具有選擇性，因此不適用于分析非poly(A)的RNA。圖4. Smart-seq測(cè)序原理
◎ 基于線(xiàn)性擴(kuò)增的MARS-seq技術(shù)
通過(guò) T7 啟動(dòng)子連在 oligo dT 引物上，可以在 cDNA 合成后啟動(dòng) IVT（in vitro transcription ），MARS-seq 2.0 是在 MARS-seq 基礎(chǔ)上，整合 index 分選以及大量平行單細(xì)胞 RNA測(cè)序方法，從而形成的一套流程。
圖5. MARS-seq測(cè)序原理單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展前景2013年，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被《Nature Methods》評(píng)為年度技術(shù)。同年，《Science》將單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得關(guān)注的六大領(lǐng)域。同時(shí)隨著技術(shù)發(fā)展更新，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)由早期的高成本、低通量及低自動(dòng)化發(fā)展到目前的低成本、高通量、高自動(dòng)化，臨床應(yīng)用得到飛速發(fā)展，能夠快速確定成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的精確基因表達(dá)模式，分析每個(gè)細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展至今僅10余年，在神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤研究、產(chǎn)前基因診斷等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，早已成為科學(xué)研究領(lǐng)域當(dāng)之無(wú)愧的焦點(diǎn)。
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