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ELISA實驗測定類型和操作步驟

來源:上海研啟生物科技有限公司   2021年09月08日 18:02  

雙抗體夾心法檢測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法,但要注意的是在一步法(待測抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng))測定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成“夾心復(fù)合物”出現(xiàn)鉤狀效應(yīng),甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應(yīng)注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。

雙抗體夾心法的簡要操作步驟為:
1)先加入抗體,使抗體固定結(jié)合于載體表面;
2)再加樣品,使目標(biāo)檢測抗原形成抗原-抗體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗抗體(第二種動物抗抗原的酶標(biāo)抗體);
4)加入酶促反應(yīng)底物,發(fā)生顯色反應(yīng),顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

競爭法檢測抗原

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結(jié)合位點,因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,可以采用競爭法模式。方法的基本原理可見圖2,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液,而另一組只加酶標(biāo)記抗原,再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

競爭法的簡要操作步驟:
1)先加入抗體,使抗體固定結(jié)合于載體表面;
2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗原混合物,同時做只加酶標(biāo)抗原的對照組;
3)加入酶促反應(yīng)底物,發(fā)生顯色反應(yīng),對比實驗組及對照組的顯色差異,計算未知抗原的量。

雙抗原夾心法檢測抗體

雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。

雙抗原夾心法的簡要操作步驟為:
1)先加入抗原,使抗體固定結(jié)合于載體表面;
2)再加樣品,使目標(biāo)檢測抗體形成抗原-抗體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗原;
4)加入酶促反應(yīng)底物,發(fā)生顯色反應(yīng),顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

間接法檢測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體(人免疫球蛋白),故稱為間接法。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

間接法的簡要操作步驟:
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原;
2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗-體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗抗體;
4)加入酶促反應(yīng)底物,發(fā)生顯色反應(yīng),顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

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