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高效液相色譜儀主要的組成部件為高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理裝置。
1.高壓輸液泵
由于高效液相色譜所使用的色譜柱一般裝填小于10μm的固定相顆粒，故對流動(dòng)相有較大的阻力，所以對于泵的耐壓有一定的要求。除此之外，對于輸液泵還有泵體材料耐化學(xué)腐蝕、輸出流量范圍寬、輸出流量穩(wěn)定等要求。
高壓輸液泵可以分為恒壓泵和恒流泵兩大類。
恒壓泵是指輸出恒定壓力的泵，當(dāng)系統(tǒng)阻力不變時(shí)可以保持恒定流量，但系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)影響到系統(tǒng)流量穩(wěn)定，因此現(xiàn)在基本已不使用。恒流泵是指可輸出恒定體積流量的泵，又分為注射型泵和往復(fù)式柱塞泵兩類。注射型泵由于其工作過程中需停流吸液以及價(jià)格昂貴等原因，目前基本不用于高效液相色譜儀中。往復(fù)式柱塞泵則可以提供低脈動(dòng)的連續(xù)穩(wěn)定液流，廣泛應(yīng)用于各種商品化儀器中，并衍生出了雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵、雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵、雙柱塞獨(dú)立驅(qū)動(dòng)的往復(fù)式串聯(lián)泵等多種設(shè)計(jì)。
2.進(jìn)樣裝置
在HPLC分析中由于使用了高效顆粒填料和高壓的流動(dòng)相，因而對樣品的進(jìn)樣方式要求提高，需要使樣品在進(jìn)入色譜柱頭時(shí)準(zhǔn)確地注人其上端填料的中心，形成集中的一點(diǎn)，以保證擴(kuò)散效應(yīng)影響降到。為實(shí)現(xiàn)以上要求有兩種設(shè)計(jì)：停流進(jìn)樣和六通閥進(jìn)樣，但現(xiàn)在停流進(jìn)樣技術(shù)已經(jīng)*被簡單易用的六通閥進(jìn)樣方式所取代。
3.色譜柱
色譜柱一般使用內(nèi)壁拋光的直型不銹鋼管作為柱管以獲得高柱效。當(dāng)使用粗內(nèi)徑短柱和細(xì)內(nèi)徑色潛柱時(shí)，需要注意柱外效應(yīng)所引起的色譜峰展寬，應(yīng)該盡量縮短進(jìn)樣器至檢測器之間的連接管路，以獲得更小的柱外死體積。
HPLC色譜柱裝填的固定相，其基體材料多為全多孔球形或無定形的硅膠顆粒，在高壓下使用勻漿裝柱法裝填，并在色譜柱兩端使用多孔不銹鋼燒結(jié)材料的過濾片以阻擋流動(dòng)相中的微小機(jī)械雜質(zhì)進(jìn)入，并防止固定相流失。
4.檢測器
檢測器主要用于檢測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化。常用的檢測器為紫外/可見光檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器等。
5.色譜數(shù)據(jù)處理裝置
高效液相色譜的分析結(jié)果數(shù)據(jù)現(xiàn)已廣泛使用色譜數(shù)據(jù)工作站來記錄和處理。色譜工作站基于微型計(jì)算機(jī)的硬件，可以實(shí)現(xiàn)如下功能：
(1) 儀器操作參數(shù)的控制功能——色譜儀的所有可控參數(shù)，均可預(yù)先設(shè)定并保存記錄，在運(yùn)行樣品時(shí)自動(dòng)調(diào)用并傳輸至儀器。
(2) 數(shù)據(jù)采集和處理功能——可通過計(jì)算機(jī)和儀器之間的數(shù)據(jù)傳輸接口自動(dòng)采集色譜數(shù)據(jù)。并根據(jù)處理參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，提供色譜圖的相關(guān)積分?jǐn)?shù)據(jù)，還可以選擇不同的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方式來對樣品自動(dòng)進(jìn)行計(jì)算，得到定性或定量的結(jié)果。還具有計(jì)算柱效、繪制工作曲線等其他功能。
(3) 計(jì)量認(rèn)證功能——通過工作站完成對儀器的自動(dòng)認(rèn)證程序，包括流量精度、色譜柱控溫精度、檢測器能量檢測等多項(xiàng)參數(shù)，并提供詳細(xì)的計(jì)量報(bào)告。 .
(4) 多臺(tái)儀器的自動(dòng)控制——可以適時(shí)控制多套HPLC、系統(tǒng)，并同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行方法設(shè)定、樣品運(yùn)行、數(shù)據(jù)采集處理。
高效液相色譜的原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶(極性不同，避免固定液流失)，有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于高效液相色譜計(jì)算公式： 高效液相色譜計(jì)算公式
式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對K影響不大，LLPC流動(dòng)相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求*不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相(見后)，可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛(70~80%)。
液—固色譜法
流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附(未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)，可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。 當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數(shù)。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數(shù)為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關(guān)系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機(jī)相 式中：X 水相--流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子(也可是陽離子)；Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基銨等)；X Y---形成的離子對化合物。 當(dāng)達(dá)平衡時(shí)： KXY = [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相[Y-]水相 根據(jù)定義，分配系數(shù)為： DX= [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關(guān)系] 離子對色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相，分離陰離子(如Br-)為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動(dòng)相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)(洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程)： 擔(dān)體圖示
抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。
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