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生物分子的分離純化是獲得有效生物產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)之一，在重組蛋白純化過程中需要考慮目的物性質(zhì)，合理選擇及組合具有各自特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)的層析技術(shù)，才能達(dá)到*的純化效果，滿足目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量、純度等多方面的要求。蛋白的分離純化及制備過程中，會(huì)產(chǎn)生沉淀，這些沉淀有可逆和不可逆2種。 蛋白發(fā)生變性，指的是蛋白分子在遭到劇烈的物理化學(xué)(如高溫、pH等)作用時(shí)，分子中的次級(jí)鍵遭到破壞斷裂，導(dǎo)致空間構(gòu)象從緊密有序的變?yōu)樗缮o序的狀態(tài)，這種清況下形成的沉淀是不可逆的。在蛋白鹽析、蛋白等電沉淀中最為常見的是蛋白質(zhì)的水化膜遭到破壞或者中和了表面的凈電荷后形成的沉淀，這種情況下形成的沉淀是可逆的，利用這一特性可以用來分離純化蛋白。 若發(fā)生可逆沉淀后，可以嘗試通過增加溶劑，調(diào)節(jié)pH，添加助溶劑等方式來處理；若發(fā)生不可逆沉淀，則可以選擇離心，過濾等方式去除。一般下列因素會(huì)影響蛋白純化過程中沉淀的形成。 1、影響蛋白純化過程中沉淀形成的影響因素 （1）蛋白自身性質(zhì) 如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易發(fā)生疏水聚合而沉淀，做過膜蛋白提取以及包涵體溶解時(shí)都有切身體會(huì)。在表達(dá)還有二硫鍵鍵的蛋白時(shí)特別容易形成包涵體蛋白，所以蛋白的氨基酸序列中，含硫氨基酸較多時(shí)也容易形成沉淀。 （2）pH值 蛋白質(zhì)大多數(shù)都在高pH時(shí)溶解性高，低pH時(shí)易沉淀，這可能與氫鍵的形成有關(guān)。但有時(shí)候更低pH時(shí)蛋白又溶解了，這一現(xiàn)象在我們用親和層析純化抗體時(shí)特別常見。鹽濃度就是鹽析效應(yīng)，高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質(zhì)聚集沉淀，常用的就是硫酸銨沉淀。鹽析沉淀通常對(duì)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)沒有破壞，再溶時(shí)活性可以*恢復(fù)。常見的例子就是硫酸銨沉淀純化IgG。同樣，硫酸銨沉淀也常碰到不可逆的情況，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)表達(dá)的重組蛋白往往在硫酸銨沉淀后再溶困難。 （3）有機(jī)溶劑 例如丙酮沉淀，但有機(jī)溶劑也不是全部對(duì)蛋白起沉淀作用，有時(shí)候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有機(jī)溶劑抽提。 （4）溫度 高溫或低溫都有可能使得蛋白質(zhì)沉淀。煮沸沉淀常見了，低溫沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。 （5）表面活性劑 對(duì)蛋白質(zhì)有助溶作用。例如做電泳的SDS就是很強(qiáng)的表面活性劑，還有TWEEN，Triton等等。 （6）還原劑 還原劑往往對(duì)蛋白質(zhì)有助溶作用。有些蛋白當(dāng)加入的還原劑在空氣中慢慢氧化后，就會(huì)沉淀析出。變性劑如尿素、鹽酸胍，包涵體蛋白在用變性劑溶解后，再去除變性劑經(jīng)常會(huì)沉淀析出。 |
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