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這是一個建議的程序，請根據(jù)你的實驗需要進行調(diào)整。保持產(chǎn)品的無菌性，在無菌條件下工作。
協(xié)議目標
該協(xié)議的目的是提供使用 INKREDIBLE、INKREDIBLE+、BIO X 或 BIO X6 的 GelXA LAMININK 生物墨水進行生物打印的說明，有無細胞。 GelXA LAMININK 系列包括GelXA LAMININK 111 、GelXA LAMININK 121 、GelXA LAMININK 411 、GelXA
LAMININK 521 和 GelXA LAMININK+。 本文件涵蓋了與細胞的預(yù)打印混合、3D 生物打印和離子交聯(lián)或通過光固化的后打印過程。 該方案針對 GelXA LAMININK 進行了優(yōu)化，其中 LAP 0.25% 未稀釋以及 10+1 細胞懸液稀釋。 改變LAP 或 bioink 的濃度與細胞懸浮液的比例會改變光交聯(lián)時間。 參考光交聯(lián)優(yōu)化協(xié)議來調(diào)整和確定這些數(shù)字。 該協(xié)議通過使用 BIO X 和 BIO X6 的溫控打印頭進行了優(yōu)化。 1
所需材料
- GelXA LAMININK Bioink*
- 交聯(lián)劑*（隨bioink采購一起提供）
- 紫外線屏蔽盒，3cC*
- 無菌錐形生物打印噴嘴，22-27g推薦*
- BioX*、BioX6*或Inkredable系列*3D Bioprinter
- 井板或培養(yǎng)皿*
- 用于光固化的405或365納米光模塊
- 細胞+細胞培養(yǎng)基
- 3毫升帶Luer鎖連接的注射器
- 陰/陰路厄鎖適配器*或
- 細胞混合器*
如果從橙色防紫外線墨盒轉(zhuǎn)印，請保持生物墨水不受光影響，以避免在打印前交聯(lián)。在黑暗模式下使用3D打印機。光引發(fā)劑對反復(fù)或長時間暴露于熱敏感。
協(xié)議
使用BIO X或BIO X6，在15°C下冷卻打印床，在24°C下溫控打印頭時，該協(xié)議工作*佳。GelXA層狀油墨也可以使用氣動打印頭或可噴墨系列進行擠壓，但如果環(huán)境溫度超過25°C且打印頭發(fā)熱，則形狀保真度會降低。如果使用可噴墨系列，打印基材如培養(yǎng)皿或孔板應(yīng)放置在冰上或另一個冷卻的表面上，以便在打印后熱凝膠結(jié)構(gòu)，然后再進行光交聯(lián)。
| 步驟 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 1 | 準備生物墨水 | - GelXA LAMININK | 如果不使用單元格打印，則直接轉(zhuǎn)到第 3 步。 - 在墨盒/注射器中加熱 GelXA LAMININK |
| 在 37°C 下保持 10 分鐘。 GelXA LAMININK 的加熱可以在氣動打印頭、水浴或培養(yǎng)箱中進行。 長時間和重 復(fù)加熱會對光引發(fā)劑的穩(wěn)定性和生物墨水的均勻性產(chǎn) | |||
| 生負面影響，需要在添加細胞之前進行額外的混合。如果不在墨盒中使用整個 3 mL 的 bioink，請使用女性 /女性 Luer 鎖適配器將所需的量轉(zhuǎn)移到注射器中，并在最佳存儲條件下保留其余的 bioink。 | |||
| 注意：如果 bioink 中有氣泡，請在 1600 rpm 下快速離心 1.5 分鐘。 | |||
| 2 | 將 GelXA LAMININ K 與細胞混合 |
- 細胞懸液 - 細胞混合器 - 母/母魯爾鎖適配器 - 帶 Luer 鎖連 接 的 3 mL 注射器 - 預(yù)熱的GelXA LAMININK |
此時，將十份bioink 與一份細胞懸液混合，注意不要將氣泡引入混合物中。有關(guān)詳細說明，請參閱Mixing Cells Protocol GelX 系列。 - 使用母/母Luer 鎖適配器將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 1 mL 細胞注射器（第1 部分）。 - 使用母/母Luer 鎖接頭將GelXA LAMININK 轉(zhuǎn)移到 12 mL 注射器（第2 部分）。 - 將兩個注射器夾在分配裝置上（第3 部分）。 - 將兩個注射器連接到混合裝置（第4 部分），然后將空藥筒（第5 部分）從另一側(cè)連接到混合裝置。 - 在分配裝置上輕輕施加壓力，將兩個注射器的內(nèi)容物混合到空藥筒中。 注意：為避免在混合bioink 和細胞懸浮液時出現(xiàn)氣隙，請在將注射器與細胞懸浮液連接之前小心地用 GelXA LAMININK 預(yù)填充Luer 鎖適配器。 如果準備 <2 mL 的 GelXA LAMININK，建議連接兩個 3 mL 魯爾鎖注射器，并在注射器之間來回混合bioink，直到它變得均勻。 |
| 3 | 冷卻并裝入墨盒 |
- 紫外線屏蔽zi彈,3CC 裝入格爾克薩 層壓 （ 及 細胞） - 無菌錐形生物打印 噴嘴, 22- 27g |
- 將墨盒放置在%1的計數(shù)器上0-20分鐘到觸角 房間 溫度。 如果 這個 生物墨水 有 被預(yù)熱后, 它 罐頭 取而代之的是 是 放置 在 a 冰箱對于 3-5分鐘，或在溫度控制下 打印頭 在24°C 對于 5 分鐘數(shù) 對于 更快 冷卻。 注： 房間 溫度 是 在內(nèi)部 20-25°C。 - 將室溫回火的GelXA層狀油墨放入 打印頭和帶有打印噴嘴的帽。如果 使用 這個 生物X 或生物 X6， 預(yù)冷這個打印床至 15°C。 |
| 注意：使用GelXA LAMININK打印時， 推薦 打印頭 溫度 對于 這個高 打印 保真度 是 20- 25°C， 雖然 這個生物墨水 罐頭 是 分配 向上 至 32°C。 | |||
| 4 | 打印 |
- 生物穿孔結(jié)構(gòu)與參數(shù) 根據(jù) 至表1。如果打印適性不理想，請調(diào)整壓力上升/下降1 kPa以擠出更多/更少 材料。 - 如果打印頭在長時間打印過程中發(fā)熱 會議或環(huán)境溫度超過25°C， 生物墨水也會加熱到25°C以上 粘度降低，當(dāng)擠出時觀察到 即使在低壓下也有很厚的細絲。在這里面凱斯, 重復(fù) 臺階 3 至 返回 至 這個 溫度范圍 對于 好打印適性。
注意：如果擠壓間隔時間過長 生物墨水 罐頭 干的 在 這個 噴嘴 造成 它 至 木屐。 如果 這個發(fā)生, 替換 與 新建 噴嘴。 | |
| - 生物穿孔器 （BIO X、BIO X6或 可墨水 | |||
| 系列） | |||
| - 嗯 板材 或 Petri 碟子 |
表1.使用稀釋/未稀釋生物油墨在20-25°C下打印連續(xù)長絲的建議最小擠壓壓力**(±2 kPa）。“稀釋”假設(shè)一份PBS到十份bioink的混合物，這是對bioink和細胞懸浮液混合條件的模擬。對于較小的稀釋度，壓力需要增加到用于未稀釋生物墨水的壓力。
**這只是推薦的啟動壓力參考值。所需的實際壓力將根據(jù)制備程序（生物墨水的量和生物墨水的實際溫度）以及活塞在墨盒中的安裝和打印表面的平整度而變化。該表是在打印頭溫度為24°C和使用PBS稀釋10+1生物墨水的情況下生成的。
| 步驟 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 5 | 交聯(lián) |
- 交聯(lián)劑和/或 - 用于光固化的405 或 365 nm 光模塊 - 細胞培養(yǎng)基 |
GelXA層狀油墨可以使用以下方法進行光交聯(lián) 這個 405 或 365 納米 光 模塊 或 離子地用CaCl交聯(lián)2-含交聯(lián) 探員。 如果 使用 兩者都有, 開始 與 光交聯(lián)。光交聯(lián) 僅限 威爾 生成 a 較硬 結(jié)果比 離子型 交聯(lián) 只有。
- 光交聯(lián)： 參見 表 2 下面 對于 推薦交聯(lián)時間。確保 生物打印GelXA層狀連接構(gòu)建體是在打印后通過冷卻 打印床（如果使用BIO X 或BIO X6)或 放置 這個 打印 基材 與 這個在冰上構(gòu)造10秒（如果使用 可噴墨系列）。如果光交聯(lián)過程中 生物打印, 設(shè)置 這個 交聯(lián)參數(shù)適當(dāng)?shù)?/span> 在 這個 G碼 對于 這個 可噴墨系列或打印頭設(shè)置頁面 對于 這個 生物 X 或 生物 X6.
注意：建議使用405納米光模塊 取而代之的是的 365 納米 一個 如果 有可能。 過度曝光 可能損壞 這個 細胞。
注： 至 驗證 這個 交聯(lián) 是 足夠, 添加 37°C 媒體至 一個 打印 嗯 而且 觀察 那個它 不 溶解。 - 離子型 交聯(lián)： 淹沒 這個 充滿細胞的交聯(lián)溶液中的結(jié)構(gòu)物30 秒到5分鐘，具體取決于結(jié)構(gòu) 大小。除去交聯(lián)液并沖洗 構(gòu)造 與 基礎(chǔ)的文化 媒體 一次。 |
表2.建議的構(gòu)建光交聯(lián)時間***。使用BIO X或BIO X6光固化模塊將每個光模塊的距離設(shè)置為5厘米。如果使用可噴墨系列光固化模塊，所需時間可能會減少。用其他參數(shù)交聯(lián)，見光交聯(lián)優(yōu)化協(xié)議。該表是使用GelXA LAMININK與間充質(zhì)干細胞生成的。使用細胞打印時，曝光時間不要超過120秒。為了在打印較厚的構(gòu)造時達到最佳的結(jié)構(gòu)完整性，建議每隔4層用365/405nm光施加3/5秒的光交聯(lián)。若在25°C以上使用bioink，每隔一層用365/405nm的光進行3/5s的光交聯(lián)，效guo好。
| 365牛米，搭接 0.25% | 405牛米，搭接 0.25% | |
| 施工深度(mm)/時間(s) | 1/5 | 1/10 |
| 3/20 | 3/30 |
***這只是一個推薦的參考交聯(lián)時間開始。交聯(lián)所需的實際時間將根據(jù)結(jié)構(gòu)物的尺寸和溫度以及光固化模塊的強度和到結(jié)構(gòu)物的距離而變化。
| 臺階 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 6 | 孵化 | -細胞培養(yǎng)基 |
- 交聯(lián)后，將所需介質(zhì)加入構(gòu)造 而且 地點 他們在 一個 孵化器。 - 在細胞培養(yǎng)基中孵育構(gòu)建物 標準培養(yǎng)條件 (37°C，5%CO2而且95% 相對的 濕度） 或根據(jù) 至 應(yīng)用程序。 |
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