單細胞懸液

流式細胞術(shù)的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此，在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數(shù)，也需把樣品制備成細胞懸液，并要求被檢細胞大小為0.2～80pm，每個樣品中至少有20 000個細胞，細胞濃度為105 ～107 個／ml。制備成的單細胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。

一．單細胞懸液的制備

1. 棄去培養(yǎng)細胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液，加入1～2ml 0.25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養(yǎng)瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

2. 加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復(fù)吹打，使其分散為單個細胞懸液，移入離心管中；

3.離心，去掉上清液，加入約0.5mlPBS液，用振蕩器使細胞分散；

4.用細滴管或注射器將細胞迅速注入4℃ 70％乙醇中，保存于4℃冰箱中備用。

二．實體懸液的制備組織單細胞

1.機械法
①用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織；
②將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿；
③用吸管或注射器抽吸細胞懸液，以分散細胞；
④ 將細胞懸液在尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)上過濾，濾出的細胞懸液細胞計數(shù)后即可使用。

2. 酶處理法
此法是實體組織分散為單個細胞的主要方法。由于不同酶對細胞內(nèi)和細胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結(jié)合組織中的二價鈣離子和鎂離子，而二價鈣離子和鎂離子有維持細胞表面完整性和維持細胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，因此，幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實體組織，提高細胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細胞培養(yǎng)時的消化方法。

①將組織剪成1～2mm3左右的小塊。

②用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0.1％～0.5％。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0.25％膠原酶，膠原酶對組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強，它僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細胞影響不大。

膠原酶常用劑量為0.1～0.3ug／ml。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時。在消化過程中，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀，經(jīng)搖動即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個細胞和少量的細胞團，可認為組織已消化充分。

③消化完畢后，將細胞懸液通過100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，以除掉未充分消化的組織。

④已過濾的細胞懸液經(jīng)800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細胞懸液，細胞計數(shù)后即可使用。

三．石蠟包埋組織的流式細胞樣品制備

外科手術(shù)獲得的新鮮實體組織，往往已進行石蠟包埋處理，如果再制成細胞懸液進行流式細胞分析，需將石蠟包埋組織進行以下步驟的處理：

1.將石蠟包埋的組織塊切成30／xm厚的切片，盡可能除去切片中石蠟成分；

2.將切片置于離心管中，用二甲苯脫蠟2次，10分鐘／次；

3.蒸餾水洗2次后，加入1ml 1％胃蛋白酶溶液中(pH 1.5)，37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘；

4.離心，所獲得的細胞沉淀可進行染色和流式細胞術(shù)分析。