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還怕細(xì)胞量不夠嗎?細(xì)胞傳代操作無保留傳授!

來源:蒂科(上海)生物科技有限公司   2021年10月29日 09:44  

細(xì)胞傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一,也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂,細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止,且也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于細(xì)胞生長或發(fā)生中毒。因此,細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋,分種成多瓶,細(xì)胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。

 

細(xì)胞傳代作為一種常規(guī)的實驗操作,不但可以擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量,同時也可以避免細(xì)胞因進(jìn)入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。所以為了讓細(xì)胞保持在對數(shù)生長期,維持細(xì)胞旺盛的分裂能力,這時候就需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。

 

細(xì)胞傳代要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行,并且根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法:

? 貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代;

? 部分貼壁生長但貼壁不牢固的細(xì)胞可以采用直接吹打傳代;

? 懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心沉淀后再分離傳代,或直接用自然沉淀法吸除上清后,再吹打傳代。

 

上次講了細(xì)胞復(fù)蘇操作,今天來講講細(xì)胞傳代的操作(適用于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng))!

細(xì)胞復(fù)蘇流程圖

細(xì)胞傳代流程圖

 

01

細(xì)胞傳代前準(zhǔn)備

? 實驗開始前,將15mL離心管、移液管、槍頭等實驗需要用到的耗材放入無菌超凈工作臺,紫外線照射30min。

? 將*培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。

? 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長密度,當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%~90%匯合度即可進(jìn)行傳代。

 

02

胰蛋白酶/EDTA消化

? 棄去舊培養(yǎng)基,PBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基,重復(fù)洗兩次。

 

注意:

貼壁加入到培養(yǎng)皿的邊緣,不能直接對著細(xì)胞加入PBS,容易把細(xì)胞都吹起來。這一步的目的是為了去掉殘余的培養(yǎng)基,殘余的培養(yǎng)基會含有血清和一些離子等,不利于接下來的消化。

棄去PBS,加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL,T75培養(yǎng)瓶加入約3mL),迅速鋪勻,保證充分接觸細(xì)胞表面(消化時間視具體細(xì)胞而定)。

? 顯微鏡下觀察消化情況,約70%~80%細(xì)胞收縮變圓后,輕拍培養(yǎng)容器外壁,使細(xì)胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入2倍胰酶量的*培養(yǎng)基輕搖培養(yǎng)容器,使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻,終止消化。

? 使用吸管或移液管輕輕吹打細(xì)胞表面,吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次,盡可能將細(xì)胞都吹打下來。

 

注意:

吹打動作不可劇烈,避免產(chǎn)生大量氣泡,否則可能損傷和損失細(xì)胞。

? 取所有細(xì)胞懸液放入無菌15mL離心管內(nèi),250×g,室溫離心4min。

 

03

細(xì)胞培養(yǎng)

? 離心后去除上清。加入適量*培養(yǎng)基,輕柔吹打細(xì)胞沉淀,充分吹散、混勻,計數(shù)。將細(xì)胞按(2.5~4)×104個活細(xì)胞/cm2接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

? 搖勻細(xì)胞,放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中。

? 傳代次日,觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞,應(yīng)予以換液。

? 待細(xì)胞生長至80%~90%匯合度,即需傳代或凍存。

 

注意事項

胰酶濃度

推薦胰酶使用濃度為0.25%-0.04%EDTA,使用之前需預(yù)熱至37℃且pH值應(yīng)維持在7.2左右。切忌消化過度(包括胰酶濃度過高、消化時間過長等),否則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、分化、狀態(tài)變差,分化能力丟失等現(xiàn)象。細(xì)胞消化過程中需要在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化程度,當(dāng)看到大部分細(xì)胞變圓不貼壁,拍打培養(yǎng)瓶兩側(cè)會有大量細(xì)胞脫落,此時應(yīng)立即終止消化;若細(xì)胞仍有大部分貼壁,可適當(dāng)延長消化時間以避免消化不*的情況出現(xiàn)。

 

細(xì)胞的差異

不同種類的干細(xì)胞差異很大,特別是與腫瘤細(xì)胞株的差異更大,很多經(jīng)驗不可以直接使用,消化時需要仔細(xì)摸索最佳的時間。

 

接種密度

干細(xì)胞傳代過程中接種密度至關(guān)重要,如果太低會導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢,甚至導(dǎo)致細(xì)胞老化,而細(xì)胞的老化是不可逆轉(zhuǎn)的。一般細(xì)胞接種密度為20000個活細(xì)胞/cm2即5×105個活細(xì)胞/T25,不同的干細(xì)胞接種密度會稍有差異,比如hMSC,我們推薦的傳代接種比例為1:2。

 

吹打細(xì)胞動作要輕柔

吹打動作不可劇烈,避免產(chǎn)生大量氣泡,否則可能損傷和損失細(xì)胞。

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