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大/小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離方法(一)

來源:蒂科(上海)生物科技有限公司   2021年11月01日 09:37  

二十世紀七十年代,F(xiàn)riedenstein從骨髓中分離出一種多能基質(zhì)細胞,呈梭形,可以進行體外克隆和多向分化,被稱為CFU-Fs(colony-formingunitfibro-blasts)。隨后,這種骨髓來源的基質(zhì)細胞被進一步發(fā)現(xiàn)是間葉組織細胞譜系的共同前體細胞,因其具有干細胞的部分特性,而被命名為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。

 

BMSCs來源方便,易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化,多次傳代擴增后仍具有干細胞特性,免疫原性低。但是不同的分離培養(yǎng)方法使得BMSCs在體外擴增時的純度、活性、表型和分化潛能差異很大,導(dǎo)致基礎(chǔ)研究結(jié)論各異和臨床試驗效果不一。因此,深入認識BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點,并根據(jù)實驗?zāi)康淖龀鱿鄳?yīng)選擇,是進行BMSCs實驗研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

01  貼壁篩選法

貼壁篩選法是利用細胞貼壁時間及貼壁牢固性的不同,逐步將非貼壁細胞和其它雜質(zhì)細胞去除的一種簡單易行的方法,常用于干細胞的培養(yǎng)中,因此用于分離BMSCs最為廣泛。

 

利用BMSCs貼壁生長特性,更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長的造血系統(tǒng)細胞即可獲得較純化的BMSCs;而且骨髓中的造血干細胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì),可促進BMSCs貼壁生長,貼壁篩選法也常被稱為直接培養(yǎng)法或者全骨髓法。

 

操作步驟

01  以頸椎脫臼法處死SPF級3-4周齡C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠,用75%乙醇浸泡。

02  隨后在鼠的腿的位置剪開外皮和內(nèi)皮,無菌狀態(tài)下取出雙側(cè)股骨和脛骨,浸泡于無菌含雙抗PBS溶液中。剔除股骨和脛骨周圍的肌肉、結(jié)締組織(圖1-1),用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。

03  用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端,暴露骨髓腔(圖1-2)。

04  用注射器以*培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨頭發(fā)白(圖1-3)。

05  收集骨髓液(圖1-4),離心(圖1-5),后加入適當(dāng)培養(yǎng)基(含20%血清)(圖1-6)接種于培養(yǎng)基皿(圖1-7)中置于37℃,5% CO2,飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(圖1-8)。

06  24-48h后去懸浮,接下來的每3天換液一次,直到需要傳代。

圖1 貼壁篩選法分離提取BMSCs | 賽業(yè)OriCell

圖1 貼壁篩選法分離提取BMSCs

 

對初次培養(yǎng)者來說,貼壁法分離BMSCs操作簡單易掌握,不易發(fā)生污染,是一個較好的分離方法。不足的是分離提取的細胞純度相對不高。

 

02  骨組織消化法

骨組織消化法操作簡單、成本低,且獲得的BMSCs純度較貼壁篩選法高,是分離BMSCs較為常用的方法。

 

操作步驟

01  參照貼壁篩選法上述操作步驟第1-3步,收集沖去骨髓的股/脛骨于無菌的培養(yǎng)皿中,用無菌眼科剪小心地將骨組織剪成約1~3mm3的碎片。

02  之后加入適量含1mg/mL Ⅱ型膠原酶的新鮮*培養(yǎng)基(含5% FBS),于37℃搖床中振蕩消化 。

03  消化結(jié)束后離心,棄上清液,用PBS清洗兩次,然后將骨碎片接種于培養(yǎng)皿中,加入適量新鮮的*培養(yǎng)基(含20% FBS)淹沒骨碎片,并置于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

04  培養(yǎng)至72h后進行半量換液。此后每3天換一次液。待貼壁細胞達到80%~90%融合,進行細胞擴增傳代。

 

使用骨組織消化法分離BMSCs也并非*有效,II型膠原酶的消化可能影響B(tài)MSCs活性及增殖能力。


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