超純RNA提取試劑盒說明書

Ultrapure RNA Kit

目錄號：K0581

保存條件：Buffer RLT 2-8℃避光保存。其他組分室溫（15-25℃）保存。

組分說明

                   Cat. No.                             K0581

                   Kit Size                              50

                   Buffer RLT                      60 ml

                   Buffer RW1                      40 ml

                   Buffer RW2（concentrate）         11 ml

                   RNase-Free Water                10 ml

                   Spin Column RM                   50

                   Collection Tube（1.5  ml）         50

                   Collection Tube（2  ml）           50

              本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本試劑盒是基于TRIzon改進后的柱式總RNA提取試劑盒，裂解液充分裂解并勻質(zhì)

化樣本，采用*的硅基質(zhì)膜吸附技術(shù)，通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下高效專一的結(jié)

合溶液中的RNA，同時最大限度的有效除去蛋白質(zhì)、無機鹽離子及有機雜質(zhì)等；可從

動物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細胞等樣品中快速提取總  RNA，每次可處理

30-50 mg組織或5×10細胞，可同時處理多個不同樣品。本試劑盒提取得到的RNA可直

接應用于RT-PCR、Northern6       Blot、Dot Blot、體外翻譯等實驗。

產(chǎn)品特點

·純度高：最大限度除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的RNA可直接用于下游各種實驗。

·提取量大：*的裂解液配方，充分裂解細胞或組織，RNA提取量多至100 μg。

·快速：步驟少，操作簡單，節(jié)省時間。

·兼容性強：適用于多種動植物組織和細胞RNA的提取。

自備試劑：氯仿(新開封或提取RNA專用)、70%乙醇(無RNase水配制)、無水乙醇。

實驗前準備及重要注意事項

1．預防RNase污染，應注意以下幾方面：

   1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

   2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5  M  NaOH中浸

   泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

   3）配制溶液應使用無RNase的水。

   4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2．樣品應避免反復凍融，否則影響RNA提取得率和質(zhì)量。

3．使用前若發(fā)現(xiàn)Buffer RLT有沉淀，可置于56℃水浴幾分鐘，即可溶解。

4．第一次使用前應按照試劑瓶標簽說明在Buffer RW2中加入無水乙醇。

5．所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

6．若下游實驗對DNA非常敏感，建議用不含RNase的DNase  I（貨號：K2090A）對

   RNA進行處理。

操作步驟

1．樣品處理

   1a.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在Buffer

   RLT中迅速研磨，每30-50 mg組織加入1 ml Buffer RLT，混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過Buffer RLT體積的10%。

   1b.動物組織：取新鮮或-70℃凍存的動物組織盡量剪碎，每30-50 mg組織加入1 ml

   Buffer RLT，勻漿儀進行勻漿處理?；蛟谝旱醒心ズ蠹尤?/span>Buffer RLT 1 ml混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過Buffer RLT體積的10%。

   1c.單層培養(yǎng)細胞：吸去培養(yǎng)液，可直接在培養(yǎng)板中加入適量Buffer RLT（每10 cm                                2

   面積需要1 ml Buffer RLT），用取樣器反復吹打使細胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后，

   將細胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細胞沉淀，仔細

   吸除所有上清，加入Buffer RLT 1 ml混勻。

   注意：1）收集細胞數(shù)量不要超過1×10⁷。

   2）Buffer RLT加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細胞數(shù)決定。如果Buffer  RLT加量不足，可能導

   致提取的RNA中有DNA污染。

   3）收集細胞時一定要將細胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會導致裂解不*，造成RNA的產(chǎn)量降低。

   1d.細胞懸液：離心收集細胞。每5×10⁶   -1×10⁷動物、植物和酵母細胞或每10⁷細菌

   注意：細胞加入1）加入1 mlBuffer Buffer RLT RLT前不要洗。 滌細胞，以免RNA降解。

   2）一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀或液氮研磨處理。

   1e.血液處理：直接取新鮮的血液，加入3倍體積的Buffer RLT（推薦0.25 ml全血加入

   0.75 ml Buffer RLT），充分振蕩混勻。

   1f.可選步驟：對于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組

   織或植物的塊莖，可以在勻漿處理后4℃，12,000 rpm（~13,400×g）離心10分鐘以除去不溶物質(zhì)，此時沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。

2．樣品中加入Buffer  RLT后反復吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白

   核酸復合物*分離。

3．以每1 ml Buffer RLT加入200 μl氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，

   室溫放置2分鐘。

    4．4℃  12,000  rpm（~13,400×g）離心10分鐘，此時樣品分為三層：紅色有機相，中間層和上層無色水相， RNA主要在上層水相中，將上層水相移到一個新的 RNase-

Free離心管（自備）中。

    5．在得到的水相溶液中加入等體積的70%乙醇（無RNase水配制），顛倒混勻。

    6．將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin

        Column RM）中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    7．向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1，12,000 rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，

        將吸附柱重新放回收集管中。

    8．向吸附柱中加入500  μl Buffer  RW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000

        rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    9．重復步驟8。

    10．12,000 rpm離心2 分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，*晾干。

         注意：這一步目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續(xù)酶促反應（酶切、PCR等）。

    11．將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的

         中間部位加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

         注意：1）RNase-Free Wate體積不應小于30 μl，體積過小影響回收率。

         2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟11。

         3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟11。