1機(jī)械法:主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法,常用的器械有組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1.1組織搗碎機(jī) 將材料配成稀糊狀液,放置于筒內(nèi)約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調(diào)速器先撥至最慢處,開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后,逐步加速至所需速度。一般用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等,轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
1.2勻漿器 先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來(lái)回研磨,上下移動(dòng),即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料,除玻璃外,還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹(shù)脂等。此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高,適用于量少和動(dòng)物臟器組織。 存在的問(wèn)題;較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌,較小的革蘭氏陽(yáng)性首以及有些亞細(xì)胞器,質(zhì)地堅(jiān)硬,易損傷勻漿閥,也不適合用該法處理。
1.3. 研缽 多用于細(xì)菌或其他堅(jiān)硬植物材料,研磨時(shí)常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨劑,以提高研磨效果。 1.44. 細(xì)菌磨 是一種改良了的研磨器,比研缽具有更大的研磨面積,而且低部有出口。操作時(shí)先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞*磨碎。
2 物理法 主要通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有:
2.1. 反復(fù)凍溶法 原理:因突然冷凍,細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。 方法:將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復(fù)幾次,由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 特點(diǎn):此法適用于組織細(xì)胞,多用于動(dòng)物性材料,對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。
2.2. 急熱驟冷法 將材料投入沸水中,維持85-90分鐘,至水浴中急速冷卻,此法可用于細(xì)菌及病毒材料。
2.3. 超聲波處理 用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,使細(xì)胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,頻高于15~20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理:可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類(lèi)型等因素有關(guān)。 行細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理:可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類(lèi)型等因素有關(guān)。
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