目前用于分離BMSCs的方法主要有五種，分別是貼壁篩選法、骨組織消化法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分離法。

上篇我們介紹了貼壁篩選法、骨組織消化法的原理和特點，這篇就和大家介紹其他三種分離方法：密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分離法，一起為您的實驗挑選合適的分離方法吧！

01

密度梯度離心法

密度梯度離心法是針對骨髓中不同細胞的大小和密度差異進行分選，骨髓細胞懸液加入到密度梯度離心液上面，通過離心使得不同類型細胞沉降至其等密度點，然后吸取特定位置富集的細胞。

常見的梯度離心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，具有低粘性和低滲透性的特性，使用密度約為1.077g/mL。在離心分層時，紅細胞及多核細胞因比重(1.080g/mL) 較大而沉降于底部，其次是單個核細胞（包括BMSCs、造血干細胞、單核細胞等） ，懸浮密度位于(1.056~1.075) g/mL，血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050g/mL。位于分離液之上的灰白色云霧狀層即為單個核細胞層，在獲取該層細胞后再通過差速貼壁法去除未貼壁細胞（如圖1）。

圖1. 密度梯度離心法分離BMSCs

使用密度梯度離心法分離BMSCs效果好，但操作嚴格，不易掌握。

02

免疫磁珠分選法

免疫磁珠分選法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合的原理。在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。

免疫磁珠分選法分為正選法和負選法。在正選法中，磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞；而在負選法中，磁珠結合不需要的細胞，游離于上清液的細胞即為所需目的細胞。

圖2. 免疫磁珠分選法分離BMSCs

由于目前BMSCs表面缺乏特異性抗原，暫時無法進行正選，故需采用CD11b負選法。CD11b被認為是粒細胞的特異性標記，其實CD11b在巨噬細胞等表面也有大量分布，而且表達的量和粒細胞差不多。鑒于骨髓基質(zhì)細胞中有核雜細胞，主要為中性粒細胞，單核細胞和巨噬細胞，因此可以采取CD11b負選法來去除這些雜細胞，從而獲得目的細胞BMSCs。

免疫磁珠分選法也是一種簡單高效的分離方法，僅需磁性分離器，不需要專業(yè)設備輔助，分離獲得BMSCs細胞通量高。

03

流式細胞儀分離法

流式細胞儀分離法原理是：當經(jīng)熒光染色或標記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內(nèi)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列，以一定速度從流動室噴口噴出。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當液滴流經(jīng)過帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。

圖3. 流式細胞儀分離法原理(Hai-jian Sun, Jian Chen, Bing Ni.et al.2015)

這種方法需要流式儀器輔助操作，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，技術難度較高。且對細胞刺激大，易污染。

總結

五種培養(yǎng)方法各有利弊，小伙伴們可根據(jù)自己的實驗目的、實驗室條件及實驗周期選擇一個最合適的方法。