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質(zhì)粒提取及原理這些你都知道嗎

來源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2021年11月03日 13:28  

DNA儲存著世代相傳的遺傳信息,被譽為“生命的密碼”。從沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的那一刻起,DNA的“魔幻之盒”被打開,越來越多不同類型的DNA分子被解密。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)DNA分子呈線性結(jié)構(gòu),例如人的染色體DNA,如果將單個體細(xì)胞中的DNA分子全部展開,長度可達2-3米。然而有一類存在于細(xì)菌中的DNA分子卻呈環(huán)狀,穿梭在浩瀚的DNA分子宇宙。雖然它的大小只有細(xì)菌染色體的千分之一,卻魔力無窮——它就是神奇的“質(zhì)?!保╬lasmid)。

左:細(xì)菌染色體DNA的線性結(jié)構(gòu);右:質(zhì)粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(By User: Spaully on English wikipedia - Own work, CC BY-SA 2.5,

質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位,當(dāng)前通常用其來特指細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的 DNA分子。

在基因工程領(lǐng)域,質(zhì)粒常常被當(dāng)做基因的載體使用。在分子生物學(xué)中,質(zhì)粒 DNA被當(dāng)做基因運載工具具有非常廣泛的應(yīng)用。

在質(zhì)粒DNA的應(yīng)用過程中,其純度對于酶切、PCR擴增等實驗結(jié)果有著比較大的影響,因此需要保證質(zhì)粒DNA提取的純度和效率。

在細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA通常按照以下步驟進行:

第一步,培養(yǎng)細(xì)菌,使質(zhì)粒擴增;

第二步,進行細(xì)菌的收集和裂解;

第三步,質(zhì)粒 DNA的分離和純化。

在質(zhì)粒DNA的提取過程中,其提取效果和其大小呈現(xiàn)出正比例關(guān)系,越小越容易進行提取,這主要是由于,如果質(zhì)粒DNA比較大的話,其特性機會和染色體DNA比較接近,這樣想要將二者分離開來難度就會變大。

在進行質(zhì)粒DNA的分離時,適宜的條件是非常重要的,主要包括pH值、SDS濃度、時間和溶菌溫度等,在適宜的條件下質(zhì)粒DNA和染色體DNA 才能夠更好的分離開來。

細(xì)菌濃度對于質(zhì)粒 DNA的提取也是非常重要的,如果細(xì)菌的濃度比較高,那么在溶菌時,溶菌液很難和細(xì)菌液充分混合,導(dǎo)致溶菌不*的問題,這樣會造成質(zhì)粒的回收率比較低;

而如果細(xì)菌溶度比較低,溶菌液和菌液均分混合,會造成溶液中含有較多的蛋白質(zhì)、染色體以及菌體碎片,在這樣的情況下,沉淀時質(zhì)?;睾线@些物質(zhì)共沉,進而導(dǎo)致質(zhì)粒的回收率也會比較低。

在生物學(xué)的相關(guān)研究之中,細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取是比較常規(guī)的技術(shù)和操作,主要的方法有堿裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等,

下面簡單介紹一下堿裂法提取質(zhì)粒。


原理


細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中,會使細(xì)胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質(zhì)變性,將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對*破壞,閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會彼此分離,這因為它們在拓?fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。


只要OH-處理的強度和時間不要太過,當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時,DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中,細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用K+取代Na+時,復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。


在SDS存在的條件下,堿水解是一項非常靈活的技術(shù),它對E. coli的所有菌株都適用,并且其細(xì)菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。

主要試劑的作用原理


氫氧化鈉的作用:在堿裂解法中,氫氧化鈉的作用原理是使細(xì)胞膜由脂雙層結(jié)構(gòu)向囊泡化轉(zhuǎn)變,從而使細(xì)胞裂解,氫氧化鈉的作用既能裂解細(xì)胞讓細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來,又是質(zhì)粒DNA和染色體DNA得以分離的關(guān)鍵。


但是對革蘭氏陽性菌來說,提取質(zhì)粒時不能直接使用堿裂解法,而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化,然后才用堿裂解法裂解細(xì)胞。這是因為革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的區(qū)別及特點不同。


十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的作用:SDS其實也是一種細(xì)胞裂解劑,其裂解細(xì)胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。此處使用SDS是因為SDS通常用作蛋白質(zhì)的變性劑和助溶劑,它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。


幾乎所有的蛋白質(zhì)能溶解在SDS中,甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中,SDS使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。


5mol/L的醋酸鉀溶液的作用:醋酸鉀溶液不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉,還使得溶液的酸堿度劇烈下降,避免染色體DNA長時間暴露于強堿環(huán)境而斷裂(斷裂后就不好去除),又使得質(zhì)粒可以復(fù)性。


此外,SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此發(fā)生了沉淀。沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽,使得沉淀更*。


由于平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。


又由于高鹽條件也會導(dǎo)致SDS形成沉淀,而5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環(huán)境促進沉淀的原理,有時也可以利用l0mol/L醋酸銨來代替。

優(yōu)點


堿裂解法在提取質(zhì)粒時具有一箭雙雕的作用:一方面是將細(xì)胞裂解,另一方面是形成高堿性的環(huán)境,使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性,為下一步質(zhì)粒DNA的復(fù)性及與染色體DNA分離做準(zhǔn)備。

鑒定


質(zhì)粒提取以后,采用瓊脂糖電泳進行質(zhì)粒DNA鑒定時,多數(shù)情況下能看到三條帶,但不是平常看到的超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。


堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA,可以采用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進行瓊脂糖電泳,就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序,分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體(即沒有復(fù)制*的兩個質(zhì)粒連在了一起)。


如果不小心在溶液(即NaOH和SDS)加入后過度振蕩,會有第四條帶,這條帶泳動得較慢,遠(yuǎn)離這三條帶,是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是,有時候抽提到的質(zhì)粒會有7-10條帶,這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈數(shù)不同)所致,這里暫不深究。




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