細胞衰老是細胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。zhong所周知,衰老的細胞表現(xiàn)為細胞體積變大,呈扁平狀;細胞核變大,核膜內(nèi)陷,染色質(zhì)聚集、固縮、裂解;胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加,有空泡形成;線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變;膜流動性降低;溶酶體內(nèi)容物增多,導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細胞所具有的上述特征成為各種細胞衰老檢測手段的依據(jù)。
其中,對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的檢測是有效檢測細胞衰老的經(jīng)典方法。X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)是β-半乳糖苷酶的底物,X-Gal本身無色,經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生半乳糖和藍色的5-溴-4-氯-靛藍。利用X-Gal的這個特點,可以間接對β-半乳糖苷酶的活性進行測定。衰老細胞中的溶酶體內(nèi)容物通常增多,使得溶酶體酶β-半乳糖苷酶的活性升高,故可以X-Gal作為底物對細胞衰老的情況進行檢測。
細胞衰老檢測方法與步驟
(1)細胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細胞片,每孔加入1×10E5個細胞,37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜,使細胞在細胞片上生長。
(2)在超凈工作臺中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,加入×1 PBS,洗滌細胞1次,隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,室溫條件下固定3~5分鐘。
(3)吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,加入×1 PBS,洗滌細胞3次,每次3分鐘。
(4)吸棄×1 PBS,加X-Gal溶液以浸沒細胞片為宜,37℃孵育4~8小時或過夜,用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。
(5)取出細胞爬片,去離子水沖洗2次,再次用固定液固定4分鐘,流水輕輕沖洗。
(6)將細胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(2分鐘)→95%酒精Ⅱ(2分鐘)→100%酒精I(2分鐘)→100%酒精I(5分鐘)→二甲苯I(2分鐘)→二甲苯Ⅱ(2分鐘)。
(7)中性樹膠封片。
(8)在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細胞形態(tài)。
每張片子鏡下計數(shù)400個細胞,確定X-Gal染色陽性細胞(衰老細胞)在細胞群體中的所占的百分比即衰老細胞率(藍染細胞數(shù)/總計細胞數(shù)×100%)。
細胞衰老檢測注意事項
①X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。
②細胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈,均會影響后續(xù)的酶反應(yīng)。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。