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干貨分享!比一比,分選細(xì)胞您需要多長(zhǎng)時(shí)間?

來(lái)源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2021年11月08日 10:34  

細(xì)胞分選在多種研究領(lǐng)域都有涉及,例如腫瘤學(xué),神經(jīng)生物學(xué),免疫學(xué)等。上次和大家分享了磁珠分選,除了磁珠分選還有流式分選,今天小編在這里跟大家聊一下流式分選的原理、應(yīng)用及與磁珠分選的區(qū)別,希望能幫到大家一二。


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流式細(xì)胞儀分選原理

流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞有兩種方法:一是“Catch Tuber”即“捕獲管法”就是機(jī)械手臂以極快的速度出入樣品液流,在細(xì)胞通過(guò)激光照射并被確認(rèn)之后快速捕獲目標(biāo)細(xì)胞至收集系統(tǒng)中,此種方法常用于小型臺(tái)式機(jī)。另一種方法是電子偏轉(zhuǎn)的方式,即將熒光染色確認(rèn)的細(xì)胞標(biāo)記正或負(fù)電荷,通過(guò)電磁場(chǎng)偏轉(zhuǎn)而分離,此種方法常用于大型科研型機(jī)器。

電子偏轉(zhuǎn)示意圖

操作流程

(1)先制備單細(xì)胞懸液(可檢測(cè)多種樣本的單細(xì)胞懸液:外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、洗脫液、實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞等)

(2)樣本染色

①核酸標(biāo)記:通過(guò)核酸染料DAPI、PI等與核酸(DNA)結(jié)合,核酸含量越高,結(jié)合的染料越多,故可以通過(guò)核酸染料的多少以及強(qiáng)弱進(jìn)行細(xì)胞周期分選。

②蛋白標(biāo)記:偶聯(lián)熒光素的單克隆抗體與細(xì)胞表面/胞內(nèi)的抗原結(jié)合,結(jié)合的量越多,熒光信號(hào)就越強(qiáng)。

③熒光報(bào)告蛋白:很多報(bào)告蛋白是熒光蛋白(GFP、DsRed等),可成為流式檢測(cè)時(shí)熒光信號(hào)的來(lái)源。

(3)細(xì)胞分選

鞘液和樣品流進(jìn)入噴嘴后,在電磁傳感器產(chǎn)生的高頻振蕩下,形成穩(wěn)定的液滴,然后將熒光染色確認(rèn)的細(xì)胞標(biāo)記正或負(fù)電荷,通過(guò)電偏轉(zhuǎn)而分離。

(4)分選后細(xì)胞可進(jìn)一步做分子生物學(xué)研究,如熒光定量PCR、western blot、細(xì)胞培養(yǎng)等。

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影響流式分選的因素

分選中我們一般都關(guān)心分選速度、分選純度、分選得率、分選活性。

(1)如何提高分選速度:

振蕩頻率、鞘液壓力、噴嘴大小、上樣速度

-振蕩頻率越高,分選速度越快;

-振蕩頻率越高,鞘液壓力也隨之增加;

-若要形成穩(wěn)定液滴,最佳振蕩頻率:f=V/(4.5d);

-鞘液壓力和噴嘴大小一定時(shí),振蕩頻率相對(duì)固定。

-上樣速度過(guò)快,得率會(huì)降低,故最佳上樣速度=1/4*f

(2)如何提高分選純度:

-精確設(shè)定液滴延遲時(shí)間(Drop Delay):指細(xì)胞通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)到液滴分離斷電位置的間隔時(shí)間。

-保證液流穩(wěn)定:鞘液和樣品流進(jìn)入噴嘴后,在電磁傳感器產(chǎn)生的高頻振蕩下,形成穩(wěn)定的液滴,即液流的斷點(diǎn)位置維持在一個(gè)固定的位置。

-選擇合適的分選模式

-排除樣本粘連

-合理設(shè)門(mén)(用散點(diǎn)圖)

-合理閾值設(shè)定

(3)如何提高分選得率:

- Drop Delay液滴延遲時(shí)間要準(zhǔn)確,液流穩(wěn)定

-如果不考慮純度的情況下(不需后續(xù)培養(yǎng)),可以選擇Enrich/yield分選模式

(4)如何提高分選活性

-與細(xì)胞本身的活性有關(guān)

-與儀器潔凈程度有關(guān)

-與鞘液壓力、噴嘴大小有關(guān)(對(duì)于脆弱細(xì)胞,盡量采用低壓和大噴嘴,包裹細(xì)胞的液滴越大,對(duì)細(xì)胞的沖擊越?。?/span>

-與上樣管路設(shè)計(jì)及管壁光滑程度有關(guān)

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流式分選和磁珠分選的比較

總結(jié):二者各有優(yōu)勢(shì),不能相互取代。

磁珠分選的優(yōu)勢(shì):

-操作簡(jiǎn)單、分選速度快、細(xì)胞活性好。

流式分選優(yōu)勢(shì):

-多參數(shù)分選,不同熒光強(qiáng)度的分選。

二者相互結(jié)合,可用于分選比例較低的細(xì)胞群。例如要分選人的造血干細(xì)胞CD43+CD38-,可以先用磁珠分選富集CD34+細(xì)胞,再結(jié)合流式分選出CD34+CD38-造血干細(xì)胞。

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流式分選的應(yīng)用

(1)流式分選在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

2013年6月,上海中科院生化所李勁松組、神經(jīng)所孫強(qiáng)組與健康所金穎組合作,建立來(lái)自食蟹猴孤雌囊胚的單倍體胚胎干細(xì)胞系,發(fā)表在Nature子刊Cell Research上,文中單倍體分選涉及到流式分選。

(2)流式分析在染色體分析分選中的應(yīng)用

瑞士的一組研究人員建立起一套符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的大規(guī)模體外擴(kuò)增異體反應(yīng)性NK細(xì)胞用于AML治療的實(shí)驗(yàn)流程,采用經(jīng)GMP認(rèn)證的BD Influx分選出單一KIR(killer lmmunoglobulin-like Receptor)特異性的NK細(xì)胞,

(3)流式分析在熒光蛋白分選中的應(yīng)用

將CFP基因插入到Abcg2基因得到基因改造小鼠,流式分選Abcg2/GFP+骨髓細(xì)胞,并移植入小鼠體內(nèi)檢測(cè)造血能力,發(fā)現(xiàn):Lin-GFP+細(xì)胞顯著富集造血干細(xì)胞,Lin-GFP-細(xì)胞無(wú)造血能力。

好了,今天小編給大家詳細(xì)的介紹了流式分選的原理、應(yīng)用及與磁珠分選的區(qū)別,希望對(duì)大家以后的實(shí)驗(yàn)有用。


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