在我們的細胞實驗中經(jīng)常會用到質(zhì)粒DNA,那么具體是怎么來的呢?今天講的是DNA的提取步驟。
前提 : 細菌繁殖步驟(挑單克隆,置于LB培養(yǎng)基中,置于37℃恒溫搖床搖過夜,180-200 rpm)。
一般市面上有很多試劑盒可供大家使用,大體步驟都差不多的啦~~我按照我所使用的試劑盒(AxyPrep中抽試劑盒)的步驟分享如下:
收集1. 50 ml離心管收集過夜搖菌的LB培養(yǎng)液(此時可以做一下判斷,如果液體未變渾濁,說明細菌并未繁殖成功,這樣肯定難以提出DNA;如果液體渾濁,便說明細菌繁殖成功啦,可繼續(xù)下面的操作),6000 g離心8 min,棄上清。
裂解2. 加250 μl Buffer S1 重懸細菌的沉淀,可以在渦旋儀上渦旋,使得沉淀全部重懸均勻,不留有小的菌塊。 3. 加250 μl Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min。
中和4. 加350 μl Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次,12,000×g離心10 min。 5. 質(zhì)粒DNA制備管插到負壓裝置的接口上。吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管中, 開啟并調(diào)節(jié)負壓至-20-30英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。
結(jié)合6. 加500 μl Buffer W1,吸盡管中溶液。 7. 加700 μl Buffer W2,吸盡管中溶液;以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。
洗滌8. 將制備管置于2 ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中,12,000×g離心1 min。
洗脫9. 將制備管移入新的1.5 ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中,在制備管膜中央加60-80 μl Eluent或去離子水,室溫靜置1 min。12,000×g離心1 min。 將Eluent或去離子水加熱至65℃將提高洗脫效率。10. 最后去檢測其濃度即可啦。
之前也用過其他的試劑盒,步驟大同小異,根據(jù)說明書步驟操作就可以了,這個實驗比較簡單的啦。
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