蛋白定量的方法有很多種,應(yīng)用較多的主要有兩種:BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法,市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時間的反應(yīng)(BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min,Bradford法反應(yīng)一般為37℃,5min),酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值,繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算WB蛋白的濃度。兩種檢測方法筆者均有使用經(jīng)驗(yàn),相比BCA法,Bradford法不僅節(jié)省反應(yīng)時間,也無需配置反應(yīng)試劑,簡單、快速、好用,筆者推薦Bradford法測定蛋白濃度。
嚴(yán)格來說,每次的蛋白濃度測定均需配制新鮮蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,保證每次測到的蛋白濃度的準(zhǔn)確性。然而,WB法評估蛋白表達(dá)水平本身就是一種半定量或者相對定量,因此在實(shí)際蛋白樣本準(zhǔn)本及濃度測定時只需保證均一性即可,即使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算同一批蛋白的濃度,如果計算準(zhǔn)備即可保證蛋白上樣時內(nèi)參水平基本一致。因此,在實(shí)際操作中我們只需測定一次標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可用此曲線來計算后續(xù)實(shí)驗(yàn)蛋白的濃度,節(jié)省時間和試劑。
具體的蛋白定量步驟,各位朋友參考試劑盒提供的方法即可,簡單易行。至于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,網(wǎng)絡(luò)亦可查到不是帖子介紹用不同軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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