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大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定
原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究心血管疾病相關(guān)機(jī)制的主要手段和基本技術(shù)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，與細(xì)胞系相比，原代心肌細(xì)胞的形態(tài)及電生理方面更接近在體細(xì)胞，因此，培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞的質(zhì)量直接關(guān)系實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程及結(jié)果。
材料與方法
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑
1）新生24h內(nèi)的SD大鼠10只，雌雄不限；
2）DMEM高糖培養(yǎng)基（CellMax）；
3）胎牛血清（CellMax）；
4）胰蛋白酶（CellMax）；
5）雙抗（CellMax）；
6）D-Hanks；
7）5-溴脫氧尿嘧啶核苷
(5-Bromoo2'-deoxyuridine，5-Brdu)；
8）臺(tái)盼藍(lán)等。
2.主要實(shí)驗(yàn)儀器
1）高性能無菌超凈臺(tái)；
2）CO2培養(yǎng)箱；
3）倒置相差顯微鏡；
4）離心機(jī)；
5）恒溫水浴鍋；
6）磁力攪拌器、
7）200目鋼網(wǎng)；
8）血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、
9）解剖器械等。
注：
所有手術(shù)器械、離心管均高壓滅菌。
玻璃器皿用強(qiáng)酸浸泡過夜，流水沖洗10次，去離子水沖洗3次，烘干后高壓滅菌備用。
3.心肌細(xì)胞培養(yǎng)
新生24h內(nèi)的SD大鼠10只，體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇浸泡消毒2遍，每次約8s。無菌眼科剪沿胸骨正中人剪，盡量避免剪破其他臟器產(chǎn)生污染。用無菌鑷子捏取心臟，迅速置于D-Hanks液中，仔細(xì)剝離大血管及多余組織，D-Hanks液反復(fù)認(rèn)真沖洗至少3次，洗去殘留的血細(xì)胞及其他雜質(zhì)。
將心臟剪成約0.5mm×0.5mm×0.5mm的組織塊放人錐形瓶，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08％的胰蛋白酶封口，放入37℃水浴鍋中消化，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速約90~100r·min-1。
第1次消化8min后靜置棄上清。剩余組織進(jìn)行多次消化，每次2min，收集每次消化后的上清液，直至全部組織消化*。向上清液中加入體積約1/4~1/3的DMEM培養(yǎng)基（含15%的胎牛血清）以終止上清液中殘余胰蛋白酶的消化作用，防止損傷細(xì)胞，保證成活率。全部上清液以1200r·min-1離心12min，所得沉淀用約20mL培養(yǎng)基輕輕吹散，用移液管緩慢吹打均勻，細(xì)胞懸液經(jīng)200目孔徑鋼網(wǎng)過濾后移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁（注意搖勻），55min后取細(xì)胞懸液以1000r·min-1離心10min，所得沉淀用培養(yǎng)基（pH=7.2）輕輕吹散。
根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度，以5×108L-1密度接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，放入37℃的溫箱中培養(yǎng)，24h后用D-Hanks液或磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗去未貼壁的細(xì)胞，可得到視野清晰、密度均勻的貼壁心肌細(xì)胞。然后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72h再次換液，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4.心肌細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)
1）心肌細(xì)胞觀察
倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)、搏動(dòng)頻率、節(jié)律、強(qiáng)度，觀察培養(yǎng)液色澤變化以判斷心肌細(xì)胞生長是否良好。
2）臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞純度的鑒定
心肌細(xì)胞懸液用等量體積分?jǐn)?shù)為0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。鏡下死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染而呈透亮狀態(tài)。
細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)（活細(xì)胞＋死細(xì)胞）×100%。
用免疫熒光法或通過細(xì)胞種板72h后計(jì)數(shù)搏動(dòng)心肌細(xì)胞百分?jǐn)?shù)測定心肌細(xì)胞純度。
心肌細(xì)胞免疫熒光鑒定
?。?）在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3min；
?。?）用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
（3）0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；
?。?）PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫（6%山羊血清，不用BSA，PBS配置）封閉30min；
?。?）吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的ACTA1一抗（一抗?jié)舛龋?:20，一抗稀釋液：PBS配置）并放入濕盒，4℃孵育過夜；
?。?）37度復(fù)溫45min，加熒光二抗（二抗換成羊抗兔IgG（H+L)/RBITC,二抗?jié)舛龋?:200，二抗稀釋液：PBS配置）：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
?。?）復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS5min×4次洗去多余的DAPI；
?。?）用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后激光共聚焦拍照。
結(jié)果
1.心肌細(xì)胞形態(tài)觀察
心肌組織消化后所有心肌細(xì)胞均為圓形，培養(yǎng)2~3h部分細(xì)胞開始貼壁，12h后可見梭形細(xì)胞，細(xì)胞逐漸增大，部分貼壁的細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)；24h細(xì)胞幾乎全部貼壁，可見多角形細(xì)胞及較多細(xì)胞搏動(dòng)；48h細(xì)胞形態(tài)為多角形或梭形，細(xì)胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，鋪滿瓶底。72h后99%以上細(xì)胞自律搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率、節(jié)律、強(qiáng)度穩(wěn)定，頻率70~130次·min-1；大部分細(xì)胞相互連接，呈現(xiàn)同步搏動(dòng)，同一培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的搏動(dòng)頻率一致。
24h心肌細(xì)胞
48h心肌細(xì)胞
2.心肌細(xì)胞活力測定結(jié)果臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活細(xì)胞數(shù)>85%。
3.心肌細(xì)胞純度測定通過細(xì)胞種板72h后計(jì)數(shù)搏動(dòng)心肌細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，所得心肌細(xì)胞純度>95%。
4.心肌細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果
心肌細(xì)胞（細(xì)胞核）
心肌細(xì)胞（ACTA1抗體表達(dá)）
心肌細(xì)胞（合成圖）
討論
1.鼠齡選擇多數(shù)文獻(xiàn)推薦1~3d大鼠，新生大鼠在出生后3d內(nèi)心肌細(xì)胞尚未分化，心肌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)成活率高。
通過大量實(shí)驗(yàn)觀察認(rèn)為最好選擇出生24h內(nèi)新生大鼠。
2.無菌操作防止污染是培養(yǎng)細(xì)胞成敗的關(guān)鍵之一。
常見為細(xì)菌、支原體等污染，可導(dǎo)致提取后的細(xì)胞不貼壁、不生長、生長后狀態(tài)不佳等。要嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室無菌操作規(guī)則且培養(yǎng)基中要加入終濃度為體積分?jǐn)?shù)1%的雙抗液。
3.組織消化反復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，0.5mmx0.5mmx0.5mm體積的組織塊更易快速消化且避免長時(shí)間消化給細(xì)胞帶來損傷。
常用消化液有胰蛋白酶及膠原酶I、Ⅱ等。胰蛋白酶濃度推薦質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.060%-0.125%，膠原酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%-0.10%。
單獨(dú)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%胰蛋白酶較實(shí)用。消化過程應(yīng)在37℃下進(jìn)行，用低速磁力攪拌器（80~100r·min-1）或手動(dòng)搖晃及吹打使酶與組織充分混勻。
4.細(xì)胞洗滌;剛消化過的細(xì)胞本身附帶消化酶，不利于細(xì)胞貼壁，因此，至少要洗滌細(xì)胞2~3次。將收集好的上清液加入含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的培養(yǎng)基以終止消化，然后離心細(xì)胞（1200r·min-1，12min）。
用培養(yǎng)基將離心后沉淀緩和吹散、混勻、過濾后再次離心（1000r·min-1，10min），如此重復(fù)1~2次，可洗去黏附細(xì)胞的消化酶，有利于細(xì)胞貼壁。
5.細(xì)胞純化：多選用差速貼壁分離法加化學(xué)抑制法。其原理是心臟組織消化后主要有2種細(xì)胞，即成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
由于在培養(yǎng)瓶中大部分成纖維細(xì)胞能在短期內(nèi)貼壁（50~120min），而心肌細(xì)胞則需2~24h，因此，通過差速貼壁法能獲得較純的心肌細(xì)胞，約95%。差速貼壁分離細(xì)胞后，要在培養(yǎng)基中加入5-Brdu，終濃度為0.1mmol·L-1，目的是抑制成纖維細(xì)胞的生長。
6.細(xì)胞種植：細(xì)胞密度約5×108L-1時(shí)，72h后可見細(xì)胞伸展、接觸，細(xì)胞間進(jìn)行信息交流，形成同步搏動(dòng);（1~3）×108L-1時(shí)可觀察單個(gè)細(xì)胞，可見到多種形態(tài)的細(xì)胞。
種植細(xì)胞24h后用磷酸鹽緩沖液或D-Hanks液輕輕洗滌培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，洗去未貼壁細(xì)胞得到可供實(shí)驗(yàn)的理想細(xì)胞。
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