流式細胞儀檢測樣品推薦制備方法:
A. 直接標記抗體(FITC標記抗體):
(1) 、收集1×106個細胞,800rpm離心5min,4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 、用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘,800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞,800rpm離心5min。
(3) 、用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細胞,冰上孵育10min,800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×105個細胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定,待測即可。
(4) 、用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細胞。
B. 未標記抗體間接免疫熒光標記法:
(1)、收集2×106個細胞,用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次,800rpm離心5min。
(2)、用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min;2ml PBS重懸細胞,800rpm離心5min;
(3)、用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細胞,冰上放置10min,800rpm離心5min。
(4)、加入飽和劑量未標記抗體,冰上放置40min,800rpm離心5min,用2ml冷的PBS 重懸細胞,800rpm離心5min,洗去未結(jié)合一抗,重復(fù)一次。
(5)、加入熒光標記(FITC)標記的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm離心5min,去上清,PBS洗滌兩次。
(6)、加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細胞;固定待測。
(7)、流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細胞。
C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品(PI染色)的制備:
(1)、待測樣本制成單細胞懸液,然后2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,棄上清。
(2)、用4℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18小時。
(3)、調(diào)整細胞濃度為106細胞/毫升,取1毫升細胞懸液,用PBS洗三次,細胞重懸于1毫升PI染液中,37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。
(4)、PI染液終濃度為50微克/毫升,RNase A終濃度為20微克/毫升。
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