ELISA必須遵守以下3個核心原理：1）抗原或抗體能吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，可根據(jù)已知濃度的抗原或抗體的顏色反應(yīng)的深淺繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依此計算出未知樣品中抗體或抗原的濃度。在ELISA中酶起到很關(guān)鍵的作用，常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還能催化酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。

ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地擴(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。在實際應(yīng)用方面可用于疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。按照待測物性質(zhì)的不同，ELISA反應(yīng)可以分為抗原檢測反應(yīng)及抗體檢測反應(yīng)。

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上，能夠進(jìn)行檢測的抗原包括：內(nèi)分泌方面的雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，血液學(xué)方面的凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等，腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），此外還有霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風(fēng)梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢測免疫抑制病人中常見的白色念殊菌抗原，檢測病人或病獸的糞便中的輪狀病毒；檢測甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細(xì)胞病毒等。

而用ELISA檢測抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷，亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學(xué)診斷，這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢測鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體作診斷，也可用于對立克次氏體的種屬鑒別，還有用于檢測鸚鵡熱衣原體抗體的報導(dǎo)。ELISA也可應(yīng)用于以下病毒抗體檢測：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過目前常用的檢測方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。

雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，但要注意的是在一步法（待測抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng)）測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：

1） 先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；

2） 再加樣品，使目標(biāo)檢測抗原形成抗原-抗體復(fù)合物；

3） 加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗抗原的酶標(biāo)抗體）；

4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

圖1 雙抗體夾心法測抗原流程示意圖

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結(jié)合位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。方法的基本原理可見圖2，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

競爭法的簡要操作步驟：

1） 先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；

2） 加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗原混合物,同時做只加酶標(biāo)抗原的對照組；

3） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對比實驗組及對照組的顯色差異，計算未知抗原的量。

圖2 競爭法測抗原流程示意圖

雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。

雙抗原夾心法的簡要操作步驟為：

1） 先加入抗原，使抗體固定結(jié)合于載體表面；

2） 再加樣品，使目標(biāo)檢測抗體形成抗原-抗體復(fù)合物；

3） 加酶標(biāo)抗原；

4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

圖3 雙抗原夾心法測抗體流程示意圖

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（人免疫球蛋白），故稱為間接法。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

間接法的簡要操作步驟：

1） 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原；

2） 加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物；

3） 加酶標(biāo)抗抗體；

4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

圖4 間接法測抗體流程示意圖

競爭法測抗體的反應(yīng)模式與競爭法測抗原類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法。

競爭法的簡要操作步驟：

1） 先加入特異性抗原，使抗原固定結(jié)合于載體表面；

2） 加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗體混合物，并做只加酶標(biāo)抗體的對照組；

3） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對比實驗組及對照組的顯色差異，計算未知抗體的量。

圖5 競爭法測抗體流程示意圖

捕獲包被法（亦稱反向間接法）ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。以目前常用的IgM測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性IgM和IgG同時存在，則后者可干擾IgM的測定。因此先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

捕獲法測抗體的簡要操作步驟：

1） 特異性捕獲抗體的包被，先把能特異性結(jié)合待測抗原的抗體固定于固相載體表面；

2） 加入待測樣品，通過固定在載體表面的針對該抗原的抗體固定于載體表面；

3） 加入特異性抗原以及針對該特異性抗原的酶標(biāo)抗體；

4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

圖6 捕獲包被法測抗體流程示意圖

除以上6種ELISA測試方法外，近年在親和素-生物素系統(tǒng)上又發(fā)展出ABS-ELISA法 。親和素是一種糖蛋白，每個分子由4個能和生物素結(jié)合的亞基組成，生物素為小分子化合物。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與抗體或酶形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便，并且不影響抗體或酶原有的生物學(xué)活性。親和素生物素系統(tǒng)，簡稱ABS（avidin-biotin system）。由于親和素與生物素間的親和力強(qiáng)，結(jié)合迅速，且極其穩(wěn)定，使BAS標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的途徑，大大提高了檢測的靈敏度，但該方法比普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，因此在臨床檢驗中ABS-ELISA應(yīng)用不多。ABS-ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。

在LAB法中，將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)記在親和素分子上，生物素化抗體與被檢抗原結(jié)合后，再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)結(jié)到抗原分子上，經(jīng)酶促反應(yīng)即可檢出抗原，因此提高檢測的敏感度。

圖7 ABS-ELISA法中的LAB法

ABC法同樣將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)在生物素上，親和素和酶標(biāo)生物素需要先按一定比例形成ABC復(fù)合物，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合了大量的酶分子，當(dāng)親和素尚未被酶標(biāo)生物素飽和時，生物素化抗體即可與之結(jié)合, 使被檢抗原、生物素化抗體和酶標(biāo)生物素聯(lián)成一體。

圖8 ABS-ELISA法中的ABC法

1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果，造成該現(xiàn)象的原因有4個：

1）試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現(xiàn)交叉污染。——應(yīng)當(dāng)更換使用試劑，小心操作；

2）酶標(biāo)板洗板不*?！獓L試用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈；

3）抗體量過多導(dǎo)致非特異結(jié)合?！獞?yīng)該根據(jù)推薦用量使用抗體，盡量使用較少的抗體；

4）夾心法、捕獲法中檢測抗體與包被抗體/抗原反應(yīng)。——確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，兩者之間不會互相反應(yīng)。

2. 酶標(biāo)板整體背景高，造成該現(xiàn)象的原因有4個：

1）抗體非特異性結(jié)合。——應(yīng)確保進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液，最好使用5%~10%的與二抗同種動物來源的血清或牛血清，確保板孔經(jīng)過預(yù)處理以防止非特異結(jié)合，使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，最好經(jīng)過了預(yù)吸收處理；

2）底物結(jié)合濃度過高或反應(yīng)時間過長。——應(yīng)調(diào)整底物的濃度，當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)；

3）底物溶液不新鮮或被污染?！獞?yīng)檢測底物溶液，正常的底物溶液應(yīng)該是清亮透明的，如果變黃或其他顏色則是被污染的標(biāo)志；

4）底物孵育過程沒有避光。——底物孵育應(yīng)該在避光環(huán)境下進(jìn)行。

3.吸光度數(shù)值偏高或偏低，造成的該現(xiàn)象的原因有4個：

1）樣品中待檢抗原含量太低會導(dǎo)致測試結(jié)果偏低?！蓢L試增加樣品的使用量或者更換一個檢測更靈敏的方法；

2）加入抗體量不合適也會造成結(jié)果偏低或偏高——應(yīng)確定使用的是建議抗體用量，或者為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量；

3）孵育時間不夠長會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低?！獞?yīng)適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合；

4）孵育溫度不適合。——應(yīng)保證抗體在最適宜并且穩(wěn)定的溫度下孵育，一般是室溫（25度）。