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ELISA試劑盒系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)邊緣效應(yīng)問題

來源:上海舒話生物科技有限公司   2022年01月15日 11:17  

包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,是否降解,這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保留抗原很重要,ELISA試劑盒做重組蛋白時一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑,從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。但有時因?yàn)樵囼?yàn)的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。


    常用封劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉,可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。詳細(xì)的試驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐,看一下可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。但選用什么,要依據(jù)試驗(yàn)詳細(xì)來實(shí)踐。

應(yīng)留意以下原理:

ELISA試劑盒因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用,這種物理吸附長短特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面。小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。還有有的包被原可能不是蛋白,對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被,親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,這種包被方法平均、牢固,已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

    我們在使用ELISA試劑盒96孔板的實(shí)驗(yàn)測定的時候,常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)",也就是外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體,在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,板也升溫時,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)",并且可提高測定的重復(fù)性。 
    還有就是在實(shí)驗(yàn)中,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。提醒注意:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。ELISA試劑盒太快的話無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以,有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。


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