關(guān)于包涵體的復(fù)性一直是生物制藥的瓶頸,包涵體的處理一般包括這么幾步:菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化。
一、包涵體蛋白的表達(dá)
在平板上挑取單菌落,接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)接到100 ml LB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至A600 為0.4~0.6時(shí),加入IPTG 至終濃度為0.5mmol/L 誘導(dǎo)3.5 h。8000 r/min 離心5 min 收集菌體,加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl,冰浴下超聲波破碎后12000 r/min離心30 min收集沉淀。
二、包涵體的洗滌
在包涵體中加入包涵體洗滌液:50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,w=0.5%TritonX-100,pH 8.0;37℃振蕩洗滌1~2 h,然后8 000 r/min 離心15 min,收集沉淀。
三、包涵體的溶解
洗滌后的包涵體加入適量的(包涵體溶解液):6 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50mmol/L NaCl,10 mmol/L β-ME,pH 8.0(注:β-ME用時(shí)現(xiàn)加),于磁力攪拌器上攪拌過夜,1000 r/min離心30 min,取上清即得包涵體溶解液。
四、包涵體的復(fù)性
包涵體的復(fù)性目前常用的主要有兩種方式:1,稀釋溶液,但是操作的液體量大,蛋白稀釋;2,透析,超濾或電滲透析去除變性劑。
1.包涵體的稀釋復(fù)性
設(shè)定不同的復(fù)性條件:蛋白質(zhì)量濃度、尿素濃度、溫度、氧化還原條件、加入Ttiton X-100與環(huán)糊精的量、復(fù)性時(shí)間等,使變性溶解的包涵體稀釋復(fù)性,復(fù)性一定時(shí)間后取樣測酶活性。
2.包涵體的透析復(fù)性
包涵體蛋白的復(fù)性將8 mol/L 尿素溶解后的樣品裝入透析袋,密封置于復(fù)性液I(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;5%甘油;5 μmol/L EDTA;pH8.5),4 ℃ 透析12 h 后再轉(zhuǎn)入復(fù)性液II(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;)4 ℃ 透析12 h,12000 r/min 離心30 min,收集上清進(jìn)行蛋白濃度及活性測定。
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