技術(shù)服務(wù)介紹

雙熒光素酶報告基因檢測是以熒光素(luciferin) 為底物來檢測螢火蛟光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化Iuciferin氧化成oyluciferin, 在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence) ，可通過熒光測定儀設(shè)備測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于啟動子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控及miRNA靶基因驗證等向研究。

雙熒光素酶通常是指螢火蛟光素酶和海腎熒光素。其中熒火蛟光素是從甲蟲(Photinuspyralis)中分離得到，分子量為61kDa;而海腎(Renilla) 熒光素酶則是從海腎(Renillareniformis)中分離,分子量為36kDa。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同:螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、 ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光;而海腎熒光素酶僅需要腔腸素(coelenterazine)和氧氣。螢火熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同:螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色,波長550-570nm;而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報告實(shí)驗中得到廣泛應(yīng)用。

雙熒光素酶報告基因檢測優(yōu)勢:單報告基因?qū)嶒炌鶗艿礁鞣N實(shí)驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的"對照"作為內(nèi)參為試驗提供-基準(zhǔn)線, 從而可以在zuidachengdu上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實(shí)驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。雙熒光素酶報告基因檢測常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上,第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上。以第一種為例，這兩種載體分別為pMIR REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開發(fā)的載體，它用來克隆插入miRNA靶序列，評估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能的載體。

另外的一個載體是pRL-TK載體，這個載體是由Promega開發(fā)的，pRL-TK是海腎熒光素酶報告載體，含有SV40增強(qiáng)子，pMIR-REPORT miRNA這個載體主要是用于評估m(xù)iRNA與靶基因3’UTR的結(jié)合，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而pRL-TK這個載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來檢測熒光時，pRL-TK這個質(zhì)粒起到一個內(nèi)參的作用。