血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的實(shí)驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)原理
在細(xì)胞培養(yǎng)工作中,常需要了解細(xì)胞生活狀態(tài)和鑒別細(xì)胞是否存活,確定細(xì)胞接種濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞活力和增殖狀況,如胰酶消化制備的細(xì)胞懸液中細(xì)胞存活率確定,凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活力檢測(cè)等。
存活測(cè)試的原理為染料排除實(shí)驗(yàn),利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色,因活細(xì)胞細(xì)胞膜完整,染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用臺(tái)盼藍(lán)染料,如果細(xì)胞不易吸收臺(tái)盼藍(lán),則用赤蘚紅B。計(jì)算細(xì)胞活率:活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼藍(lán)染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,隨時(shí)間延長(zhǎng),部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)與蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
注意事項(xiàng)
滴細(xì)胞懸液時(shí)要干凈利落,加量要適當(dāng),過(guò)多易使蓋片漂移,或淹過(guò)蓋片也會(huì)失敗,應(yīng)重做;過(guò)少易出現(xiàn)氣泡;不理想時(shí),應(yīng)重做。
鏡下計(jì)數(shù)時(shí),若方格中細(xì)胞分布明顯不均勻,說(shuō)明細(xì)胞懸液混合不均勻,需重新將細(xì)胞懸液進(jìn)行混合,再重新計(jì)數(shù)。
計(jì)數(shù)時(shí),對(duì)于位于邊線或交界處的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán),遵循“計(jì)上不計(jì)下,計(jì)左不計(jì)右”的規(guī)則。
一個(gè)細(xì)胞團(tuán)計(jì)做一個(gè)細(xì)胞。
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),最適濃度為5~10×105細(xì)胞/ml,此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液,可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。如果細(xì)胞數(shù)目很少則要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。
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