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南京大學(xué)團(tuán)隊實現(xiàn)單個活細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的分析 | 前沿用戶報道

來源：HORIBA科學(xué)儀器事業(yè)部 2022年02月21日 08:38

供稿：溫艷蓉

成果簡介

2021年6月，南京大學(xué)劉震教授團(tuán)隊在Nature子刊Nature Protocols上發(fā)表了題為 “Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays”的論文，創(chuàng)新性地發(fā)展了單細(xì)胞等離激元免疫夾心法，成功實現(xiàn)了單個活細(xì)胞及活體動物內(nèi)多種低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的分析。

背景介紹

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位，基于細(xì)胞的研究是生命科學(xué)的基礎(chǔ)。其中，基于單細(xì)胞分析的生命科學(xué)研究能夠從更深的層次上揭示生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，為探究重大疾病的起因、發(fā)展和治療提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。

蛋白質(zhì)是生物學(xué)功能的直接執(zhí)行分子，在單個細(xì)胞內(nèi)分子數(shù)目少于1000個拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)被稱為低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)。雖然低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的豐度極低，但它們在多種重要的生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用?？v觀整個單細(xì)胞分析技術(shù)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的分析手段遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于基因組和轉(zhuǎn)錄組的分析方法，其最根本的原因是蛋白質(zhì)的研究缺少類似于PCR的擴(kuò)增工具，導(dǎo)致很多低豐度的蛋白質(zhì)十分難以檢測。因此，發(fā)展適用于單細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

劉震教授團(tuán)隊將免疫識別與等離激元拉曼檢測技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)新性地發(fā)展了一種等離激元免疫夾心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA），成功實現(xiàn)了單個活細(xì)胞及活體動物內(nèi)多種低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的分析（Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55, 13215）。此后，該方法還擴(kuò)展到單個活細(xì)胞中的microRNA的分析（Chemical Science, 2018, 9, 7241）以及基于生理樣品中的蛋白質(zhì)和microRNA標(biāo)志物的疾病診斷分析（Analytical Chemistry, 2016, 88, 12363；Analytical Chemistry, 2019, 2019, 91, 4831；Analytical Chemistry, 2019, 91, 9993；Biosensors and Bioelectronics, 2019, 145, 111729）。同時，該技術(shù)還被成功應(yīng)用于單細(xì)胞信號通路研究和抗癌藥物活性評價（Analytical Chemistry, 2020, 92, 12498）等應(yīng)用。

圖文導(dǎo)讀

單細(xì)胞等離激元免疫夾心法（scPISA）的工作流程示意圖如圖1所示。包括三個主要步驟：細(xì)胞內(nèi)萃取、標(biāo)記和檢測。

1.將固定有親和配基的金基微萃取探針在顯微操作系統(tǒng)的控制下，準(zhǔn)確地插入單個活細(xì)胞內(nèi)特定部位進(jìn)行目標(biāo)蛋白的富集。

2.萃取一定的時間后將微萃取探針從細(xì)胞內(nèi)拔出，經(jīng)過適當(dāng)?shù)那逑床襟E降低微萃取探針表面的非特異性吸附，再用親和配基功能化的銀基納米拉曼標(biāo)簽對富集到的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，從而在微萃取探針表面形成類似三明治夾心結(jié)構(gòu)的微萃取探針-目標(biāo)蛋白質(zhì)-納米拉曼標(biāo)簽免疫復(fù)合物。

圖1. 單細(xì)胞等離激元免疫夾心法的工作示意圖

3.將共聚焦拉曼光譜儀和細(xì)胞顯微操作平臺耦合（圖2 c），使用拉曼光譜儀的DuoScan功能對懸掛在細(xì)胞顯微操作臂上的微探針進(jìn)行分析（圖2 d），從拉曼的強(qiáng)度信息中得出細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白的豐度，細(xì)胞內(nèi)分布等信息（圖2 f）。HORIBA共聚焦拉曼光譜儀的DuoScan功能可以對微萃取探針的各個區(qū)域進(jìn)行原位分析，所得到的信號強(qiáng)度變化反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白的相應(yīng)變化，能夠?qū)崿F(xiàn)“所見即所得”。當(dāng)激光照射在該免疫復(fù)合物的表面，金基微萃取探針和銀基納米拉曼標(biāo)簽之間納米級間隙內(nèi)由于等離激元耦合作用產(chǎn)生“熱點(diǎn)”，顯著地增強(qiáng)納米標(biāo)簽的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）信號，靈敏度達(dá)單分子水平，從而能夠?qū)崿F(xiàn)低拷貝數(shù)生物分子的檢測。

圖2. 拉曼光譜采集與分析

HORIBA XploRA INV多功能拉曼成像光譜儀集成研究級倒置顯微鏡，專為生命科學(xué)研究而設(shè)計。不僅具備通常的拉曼光譜測量功能，而且可以實現(xiàn)超快速拉曼光譜成像、熒光成像、超快速PL光譜成像等。

HORIBA Scientific 創(chuàng)新的DuoScan™技術(shù)，將拉曼儀器的成像能力從亞微米級擴(kuò)展到宏觀尺度，從深紫外到紅外，掃描共焦圖像變得更快、更容易、更靈活。

HORIBA XploRA INV多功能拉曼成像光譜儀

如果您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎掃描二維碼留言，我們的工程師將會及時為您答疑解惑。

文獻(xiàn)信息

Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays

文章署名作者：

Jia Liu, Hui He, Dan Xie, Yanrong Wen, Zhen Liu

劉震教授簡介

南京大學(xué)特聘教授，博士生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者。英國皇家化學(xué)會會士、中國化學(xué)會高級會員、美國化學(xué)會會員，兼任國際分子印跡學(xué)會理事會理事、中國質(zhì)譜學(xué)會常務(wù)理事、中國化學(xué)會質(zhì)譜專業(yè)委員會委員、中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會蛋白質(zhì)組學(xué)專業(yè)委員會委員、《Analytica Methods》副主編、《Electrophoresis》、《Separation Science Plus》等雜志編委。主要從事分子識別、親和分離、疾病診斷、單細(xì)胞分析和癌癥納米治療等研究，主持國家重大科研儀器項目和基金委重點(diǎn)項目等國家級科研項目10余項，已在Chemical Society Review，Accounts of Chemical Research，Angewandte Chemie International Edition，Nature Protocols，Chemical Science等期刊上發(fā)表論文150余篇，目前h因子49（谷歌學(xué)術(shù)），主編及合著著作2部，出版專章7章，獲授權(quán)專利15項。

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