僅供科研使用，不可用于臨床診斷和治療

凍存細胞接收后的處理：

1）干冰運輸，收到細胞后推薦直接復蘇1管，另一管放入-80度冰箱保存過夜后轉入液氮，細胞直接轉入液氮暫存可能導致細胞復蘇率降低。

2）收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已經(jīng)*揮發(fā)、凍存管瓶蓋破裂脫落,請立即拍照后與我們聯(lián)系。

復蘇細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，請首先檢查培養(yǎng)瓶是否破損或漏液，培養(yǎng)液是否混濁，如有漏液及培養(yǎng)液混濁情況請立即拍照把圖片發(fā)給我們。

2）在顯微鏡下確認細胞狀態(tài)并拍照100倍和200倍的照片2~3組以及培養(yǎng)瓶外觀照留存。

3）75%酒精消毒瓶身后放培養(yǎng)箱中靜置4-6h后，在顯微鏡下確認細胞狀態(tài)并拍照100倍和200倍的照片，若有貼壁細胞脫落，可收集上清離心，1000rpm離心5min，離心后棄去上清，用新鮮*培養(yǎng)基重懸后加入T25培養(yǎng)瓶或60mm皿中，補加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基。

3）建議收到當天不要消化處理，如果細胞長滿90%，可選擇傳代處理。

4）如您收到細胞7天內(nèi)沒有反饋相關問題，出現(xiàn)的細胞問題將不提供免費重發(fā)服務。

注：發(fā)貨用培養(yǎng)基不可再次用來培養(yǎng)細胞

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入 1~2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿底細胞，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③細胞消化0.5-2min（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷，難消化細胞可適當延長消化時間），顯微鏡下觀察細胞，細胞回縮，即將脫壁而未脫壁時（可用槍輕輕吹打確認細胞是否脫壁），加入新鮮的*培養(yǎng)基終止消化（若消化過度可能會對細胞存活率產(chǎn)生較大影響）；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤加1-2ml新鮮*培養(yǎng)基吹勻重懸后按照1:2比例加入2個T25培養(yǎng)瓶或60mm皿中，補加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

注：第一次傳代推薦1:2傳代，后續(xù)可根據(jù)細胞生長以及客戶需求自行確定。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻；

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml新鮮*培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶或者60mm培養(yǎng)皿

中，補加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入2 ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿底細胞，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

②細胞消化0.5-2min（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細胞，細胞回縮，即將脫壁而未脫壁時（可用槍輕輕吹打確認細胞是否脫壁），加入培養(yǎng)基終止消化（若消化過度可能會對細胞存活率產(chǎn)生較大影響）；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加入配制好的凍存培養(yǎng)液重懸細胞，凍存液的添加量按細胞最終濃度為1~10×10⁶/ml添加；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。