国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>解決方案>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

攻無不“克”的無縫克隆為何備受青睞?

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2022年03月18日 16:52  
攻無不“克”的無縫克隆為何備受青睞?


導讀


在經(jīng)歷了多次PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化后,有些小伙伴仍會面臨克隆陽性率低的情況,每一步都認真地完成,但仍然存在不少的問題。今天小翌給大家介紹一下近年來備受科學家們青睞的“無縫克隆”。相比于傳統(tǒng)的酶切克隆,無縫克隆更快更靈活,不受酶切位點限制,可以在質(zhì)粒的任何位點進行一個或多個DNA段的插入。

傳統(tǒng)酶切克隆

1. 受限制性內(nèi)切酶的限制
2. 連接效率低:T4 DNA連接酶連接效率具有序列的偏好性
3. 耗時長:酶連過夜
4. 多片段克隆困難

1647499200890576.png
圖1.傳統(tǒng)酶切克隆

無縫克隆

1. 無需考慮酶切位點,適用任意載體、任意片段
2. 陽性率高,可用于50 bp -10 kb的片段
3. 連接快速,20-30 min即可完成
4. 可用于多片段克隆、基因突變、多順反子表達載體構(gòu)建

1647499219650721.png
圖2.無縫克隆


無縫克隆的原理

與傳統(tǒng)的雙酶切克隆一般,無縫克隆依賴于dsDNA的黏性末端進行互補配對,但無縫克隆并不使用內(nèi)切酶來制造黏性末端,而是通過T5核酸外切酶來產(chǎn)生的。T5核酸外切酶能夠沿著5’→3’方向,降解dsDNA,從而產(chǎn)生黏性末端,但是,T5外切酶并不能保證每一個片段5’端都會酶切成一樣長的粘性末端。因此退火之后,無縫克隆中的DNA聚合酶會針對缺失的堿基進行添加,Taq連接酶催化堿基之間形成磷酸二酯鍵,將所有缺口補齊。

1647499246530241.png
圖3.無縫克隆原理圖


無縫克隆優(yōu)勢詳解

1. 不受片段、載體序列的限制,可任意組裝


傳統(tǒng)的酶切克隆:克隆載體的多克隆位點需攜帶可用的單一酶切位點,同時酶切位點若存在于外源片段也會極大程度限制克隆。此外,還需要購買各式各樣不同的內(nèi)切酶。

無縫克隆:僅靠同源臂進行互補配對。

2. 可同時無縫地拼接多個片段


傳統(tǒng)的酶切克隆:由于酶切位點的限制和酶切位點之間存在著一定的距離和交叉覆蓋,可組裝的片段有限,酶切克隆通常需要分多次拼接,一般只能拼接2-3個片段,耗時耗力。

無縫克隆:可同時拼接4-6個片段,并且只需要將所有片段混在一個試劑管中反應即可。

3. 操作簡便,時間上大大節(jié)省


傳統(tǒng)的酶切克隆:傳統(tǒng)的片段和載體酶切均需要2-4小時,此外還需要對相關(guān)產(chǎn)物進行末端補平、磷酸化、產(chǎn)物純化等一系列操作。為保證連接成功,還需在16℃條件下過夜連接。

無縫克隆:僅需PCR和膠回收,連接體系反應時間為20min左右,連接單個和多個片段的時間一致。相比于傳統(tǒng)酶切克隆,可節(jié)約1天左右的時間。


無縫克隆操作步驟

1647499279507288.png
圖4.無縫克隆關(guān)鍵步驟

1. 線性化載體制備


① 線性化方式:酶切或者PCR;
② 產(chǎn)物純化:膠回收/PCR產(chǎn)物純化;

2. PCR獲取目的插入片段


5’引物需要和線性化載體末端15-25 bp的序列重疊。

小翌推薦使用引物設計工具:122.112.245.84:8080/hieff-clone/

3. 重組反應

按一定比例將線性化載體與插入片段進行混合,50℃反應20 min后即可用于轉(zhuǎn)化。

分子克隆發(fā)展至今,翌圣利用同源同組的原理,匠心研發(fā)了多款一步法快速克隆產(chǎn)品。自產(chǎn)品上市以來,受到了諸多客戶的支持,備受好評。以下是部分產(chǎn)品的性能展示:

1647499315843085.png
圖5. Hieff Clone® One Step Cloning Kit(CAS#10911)試劑盒可以有效克隆不同長度的單片段基因。載體:4.7 kb。插入片段:1.2 kb,3 kb和5 kb。

1647499330996475.png
圖6.Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit(CAS#10912)試劑盒進行3個片段克隆。載體:10 kb。插入片段:1 kb,1.5 kb和2.5 kb。

1647499344571193.png
圖7.Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit(CAS#10922)試劑盒進行5個片段克?。ㄉ希?個片段克?。ㄏ拢]d體:5 kb。插入片段:4kb(上)和5 kb(下)。


產(chǎn)品已發(fā)表文獻


向下滑動查看

1. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. (IF 37.205)

2. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019. (IF 31.398)

3. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. (IF 31.398)

4. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158. (IF 20.46)

5. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7. (IF 14.548)

6. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019. (IF 14.548)

7. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of peptide-MHC class I conformations determines TCR antigen recognition[J]. Molecular cell, 2019, 73(5): 1015-1027. e7. (IF 14.548)

8. Qiao HH, Wang F, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila[J]. Nat Commun. 2018 Oct 8;9(1):4160. (IF 12.353)



產(chǎn)品推薦


分類
名稱
貨號
規(guī)格
單片段一步法克隆
Hieff Clone® Plus One Step  Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒
10911ES20
20 T
多片段一步法克隆
Hieff Clone® Plus  Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒
10912ES10
10 T
單/多片段一步法克隆NEW
Hieff Clone® Universal One  Step Cloning Kit 通用型一步法快速克隆試劑盒
10922ES08/20
5/20 T






免責聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權(quán)行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
通海县| 临夏县| 砚山县| 申扎县| 海南省| 丘北县| 穆棱市| 梧州市| 花莲市| 灵璧县| 宝兴县| 潞城市| 靖安县| 城步| 乌拉特后旗| 达州市| 桃江县| 昭通市| 彭水| 龙胜| 阳高县| 敦煌市| 峨边| 临安市| 大方县| 信阳市| 景德镇市| 苏州市| 淳安县| 哈尔滨市| 延庆县| 兴宁市| 夏津县| 塔河县| 仪征市| 德庆县| 仙游县| 和平县| 武汉市| 伊吾县| 永兴县|