生物體是由復(fù)雜多樣的細(xì)胞構(gòu)成的，其結(jié)構(gòu)與功能通常是作為一個整體表現(xiàn)出來的。在器官乃至全身水平上，高分辨地獲取生物組織三維結(jié)構(gòu)信息對諸多生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究至關(guān)重要，例如神經(jīng)科學(xué)中大腦神經(jīng)元連接信息的繪制、發(fā)育生物學(xué)中器官的形態(tài)發(fā)生等。

近年來興起的組織光透明技術(shù)是利用化學(xué)或物理的原理與方法將大塊組織或完整器官甚至活體動物透明化處理的技術(shù)，通過采用多種物理、化學(xué)的手段，減小組織對光的衰減，使得生物組織變得對光“透明”，從而提高了光學(xué)成像的成像深度與成像質(zhì)量。該方法與多種熒光標(biāo)記技術(shù)、光學(xué)成像技術(shù)的結(jié)合為高分辨獲取組織器官的三維整體結(jié)構(gòu)信息提供了重要的手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)機(jī)械切片顯微成像技術(shù)的不足，在生命科學(xué)特別是在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響，作為新興起來的一種生物組織學(xué)技術(shù)，受到了越來越多科研人員的關(guān)注與青睞。

                                               圖1：組織光透明方法的兩大策略：減少光散射與光吸收

       很早就見諸報(bào)道的組織光透明技術(shù)是德國科學(xué)家Werner Spalteholz用苯甲醇和methyl salicylate混合物“清除”心臟等大型器官。而比較早的嘗試腦組織光透明的方法，可以追溯到2007年維也納科技大學(xué)和德國馬普研究所的研究者使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物（BABB）透明小鼠全腦，并繪制出3D小鼠腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在此之后組織光透明技術(shù)迅猛發(fā)展，到如今已經(jīng)有幾十種組織光透明相關(guān)技術(shù)。

圖2：不同離體組織透明方法發(fā)展歷史

正常的生物組織中成分復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素等物質(zhì)對光的傳播造成阻礙。光透明技術(shù)使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液通過浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達(dá)到視覺下透明或光學(xué)儀器下可見的效果，簡單來說就是讓這些生物組織具有光學(xué)透明特性，利用這種技術(shù)實(shí)現(xiàn)透明的腦標(biāo)本稱為透明腦。Dodt 等人在2007年首先完成了對出生后10天幼鼠全腦的透明，并命名為Murray透明法或BABB。Murray透明法的出現(xiàn)使得完整觀察神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成為可能，并帶動了現(xiàn)代組織透明技術(shù)的發(fā)展。這種技術(shù)的優(yōu)勢在于不破壞組織完整性的同時(shí)具有三維成像的能力。在此基礎(chǔ)上，組織透明技術(shù)經(jīng)諸多科研機(jī)構(gòu)努力涌現(xiàn)出了多種具體方法,并不斷完善和持續(xù)更新;首先實(shí)現(xiàn)透明的器官是腦，逐漸拓展至脊髓及其他器官;組織透明適用的物種也由起初的小鼠，逐漸擴(kuò)展到大鼠、兔、非人靈長類動物乃至人類。

圖3：大小鼠不同離體組織器官透明前后圖

完整的器官之所以不透明與其組成物質(zhì)有關(guān)，組織中含有水、蛋白質(zhì)、脂類等多種不同物質(zhì)，各物質(zhì)折光系數(shù)不盡相同,當(dāng)光線通過這些不同組分時(shí)發(fā)生散射，并且組織或完整器官越厚散射越強(qiáng)透射越少，從而導(dǎo)致光學(xué)觀察受到了限制?；谶@一理論，現(xiàn)有的光透明技術(shù)的原理大致可分為兩類：一類是去除折光系數(shù)差異較大的物質(zhì),選擇性的去除組織器官中的某些物質(zhì)可以減少折光系數(shù)間的差異。鑒于蛋白質(zhì)是絕大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)研究的目標(biāo)分子，所以需要使用脫水或脫脂的方法來實(shí)現(xiàn)組織透明，而且脫水或脫脂越*，組織透明效果越好。第二類主要是使用與組織折光系數(shù)相似的介質(zhì)溶液利用浸泡或灌注的方式使組織器官透明。事實(shí)上隨著光透明技術(shù)的不斷發(fā)展，幾乎沒有一種透明方法單純的使用一種透明原理，而是綜合多種原理來實(shí)現(xiàn)組織透明。

                                                                               圖4：組織光透明原理

       由于研究的需要，許多時(shí)候需要在研究生物體存活時(shí)觀察并監(jiān)測體內(nèi)活動，如在活體動物觀察腦血管或腦神經(jīng)。目前腦血管或腦神經(jīng)的在體觀察主要通過光學(xué)顯微鏡，此類光學(xué)儀器在要求分辨率的情況下無法實(shí)現(xiàn)較深層成像，其成像對比度和深度都受到限制。因此將光透明技術(shù)引入到活體組織觀察腦血管或腦神經(jīng)，在解決成像對比度和深度這兩大關(guān)鍵問題方面具極大潛力。佳維斯（武漢）生物醫(yī)藥有限公司核心技術(shù)團(tuán)隊(duì)將活體光透明技術(shù)引入到激光血流成像和雙光子顯微成像的相關(guān)研究課題中，根據(jù)長期對該技術(shù)的研究和發(fā)展形成了活體顱骨光透明技術(shù)、活體皮膚光透明技術(shù)和活體硬組織光透明技術(shù)等活體光透明系列技術(shù)，可大大提高活體顱骨及皮膚成像深度與分辨率。

圖5：顱骨透明試劑盒透明顱骨

      激光散斑血流成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)直觀地觀察皮下血管結(jié)構(gòu)并評估其功能，不僅是了解正常的活體器官生理，而且對觀察各類疾病中微血管功能障礙進(jìn)展與神經(jīng)退行性變之間的關(guān)系也至關(guān)重要。其原理為觀察目標(biāo)受到激光束照射時(shí)，反射后的激光形成隨機(jī)干擾圖像（包括亮區(qū)和暗區(qū)），該圖像稱為激光散斑圖。如果被測目標(biāo)靜止，激光散斑圖也保持不變；如果被測物體發(fā)生移動，例如組織中的紅細(xì)胞運(yùn)動，則激光散斑圖會隨之波動。散斑變化速度以散斑對比度量化，而對比度與血流相關(guān)；這就是激光散斑血流成像技術(shù)用于血流流速變化和灌注量評估的工作原理。

圖6： 激光血流成像法觀察活體小鼠中動脈栓塞再釋放過程中（MCAo）大腦皮層上血流分布的時(shí)空變化

       就像所有的光學(xué)成像技術(shù)一樣，激光散斑血流成像技術(shù)也受限于成像深度，對皮膚表面的血管和血流能夠成像，再深層就很難進(jìn)行觀察。引入活體光透明系列技術(shù)，不但可以提升激光散斑血流成像深度，而且提升了分辨率，以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活體光透明后激光散斑血流成像的結(jié)果更清晰，背景更為“清澈”。

        （a）為小鼠耳朵圖像，（b）為透明化5min后圖像，        （c）為10min后圖像

  圖7：耳朵和顱骨透明前后激光散斑圖

     在很多動物實(shí)驗(yàn)中都需要開顱手術(shù)以進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，活體顱骨光透明后無需開顱即可進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。目前完整顱骨是觀察小鼠大腦皮下神經(jīng)和血管的主要障礙，為了克服這一障礙，科研工作者們開發(fā)出幾種類型的顱窗，包括磨薄顱窗、開顱手術(shù)和磨薄加固顱窗等。這些顱窗在某些情況下滿足研究要求，但有局限性。例如，在顱骨窗變薄的情況下，很難進(jìn)行大面積重復(fù)成像；開顱手術(shù)幾乎不可避免地會導(dǎo)致皮質(zhì)損傷和炎癥；至于磨薄加固顱窗操作復(fù)雜且也會造成損傷。而活體組織光透明的應(yīng)用解決了這些問題。通過在顱骨上進(jìn)行組織光透明，可直接觀測小鼠大腦皮下血管，不用對顱骨造成損傷。

圖8：顱骨透明前無法觀察到任何血管，顱骨透明15min后，肉眼可見大量皮質(zhì)血管。在PBS清洗干燥后，頭骨再次回復(fù)最初狀態(tài)。再反復(fù)透明處理，還能觀察到血管。最后在同一區(qū)域建立光學(xué)顱窗，與透明后效果類似。觀察到的皮質(zhì)血 管結(jié)構(gòu)與通過光學(xué)透明顱窗觀察到的相同，兩種情況下都能清楚地區(qū)分大血管和微血管。

       如同激光散斑成像碰到“小鼠顱骨”的問題一樣，在皮質(zhì)上小鼠顱骨也阻礙了熒光標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和微血管的觀察。同樣，活體顱骨光透明技術(shù)也能輔助雙光子顯微鏡進(jìn)行更深層成像，無需顱窗手術(shù)“越過”顱骨成像觀察大腦皮層結(jié)構(gòu)。

      圖9：活體顱骨光透明前后大腦皮層神經(jīng)雙光子成像

      根據(jù)以上結(jié)果可以明顯發(fā)現(xiàn)，活體光透明處理后雙光子成像的信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且成像深度也大大提高。這些結(jié)果表明，光透明處理顱骨不僅提高了雙光子顯微鏡的成像分辨率和對比度，而且還大幅提升了成像深度。

活體顱骨光透明技術(shù)操作簡單、安全有效，結(jié)合雙光子顯微鏡或激光血流成像儀，能夠反復(fù)觀察腦皮層的微血管、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞等。與現(xiàn)有的顱窗手術(shù)技術(shù)相比，無需對顱骨進(jìn)行磨薄或移除，從而不會造成損傷。這種方法也被證明是安全的，幾乎不會造成意外損傷或感染。由于不會造成炎癥，此技術(shù)也更適合對微環(huán)境高度敏感的免疫細(xì)胞（膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行研究。因此，活體顱骨光透明技術(shù)無需對顱骨進(jìn)行磨薄或切除，可以在大腦正常狀態(tài)下觀察皮層神經(jīng)和血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能，且可以長期可逆透明成像觀測。

 圖10：活體顱骨光透明技術(shù)是一種無損非侵入的顱窗透明方法，能夠大幅度提升成像深度、透明后成像背景“清澈“從而提高成像質(zhì)量，透明的速度極快（僅需15分鐘即可完成），最主要的特點(diǎn)：移除光透明劑后顱骨可再生，可進(jìn)行多次重復(fù)成像。

        活體光透明技術(shù)作為一種新興的活體成像樣本制備技術(shù)，具有革命性的意義。在維持活體器官活性和完整性的同時(shí)具有光透明特征，輔助及近紅外成像等方面，可大大提高這些活體光學(xué)檢測設(shè)備成像深度和分辨率。