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單克隆抗體的制備過程有幾點(diǎn)

來源:匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司   2022年04月08日 18:16  
  單克隆抗體是由高度一致的免疫細(xì)胞制成的抗體,這些免疫細(xì)胞是單一親本細(xì)胞的所有克隆。單克隆抗體具有單價(jià)親和力,因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合相同的表位(抗體識(shí)別抗原的部位)。相反,多克隆抗體結(jié)合多個(gè)表位,通常由幾個(gè)不同的漿細(xì)胞(分泌抗體的免疫細(xì)胞)譜系組成。也可以通過將一種單克隆抗體的治療靶點(diǎn)增加到兩個(gè)表位來設(shè)計(jì)雙特異性單克隆抗體。
  單克隆抗體制備過程
  1. 免疫動(dòng)物
  免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠,按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官,刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆,使其活化、增殖,并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。
  2.細(xì)胞融合
  采用二氧化碳?xì)怏w處死小鼠,無菌操作取出脾臟,在平皿內(nèi)擠壓研磨,制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合,并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,形成雜交瘤細(xì)胞。
  3.選擇性培養(yǎng)
  選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞,一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中,未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性,因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
  4.雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化
  在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞,只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞,因此,必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法,篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后,及時(shí)進(jìn)行凍存。
  5.單克隆抗體的大量制備
  單克隆抗體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
  (1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周,可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可獲得大量單克隆抗體。
  (2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中,雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,收集培養(yǎng)上清液,離心去除細(xì)胞及其碎片,即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn),大大提高了抗體的生產(chǎn)量。

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