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激光熒光共聚焦顯微鏡的工作原理

來源:Nanoscope Systems lnc   2022年04月12日 16:11  

背景

激光熒光共聚焦顯微鏡(CLSM)是近代先進(jìn)的細(xì)胞生物分析/儀器之一。是在1957年,Marvin Minsky首先提出這一概念,經(jīng)過多年的發(fā)展才實(shí)現(xiàn)顯微鏡所需要的激光束掃描技術(shù),點(diǎn)對點(diǎn)掃描構(gòu)建二維圖像以及到后期根據(jù)多張二維光學(xué)圖像構(gòu)建三維圖像。激光共聚焦顯微鏡是在熒光成像的基礎(chǔ)上加裝激光,激光掃描器,針孔等裝置,使用可見光激光熒光探針結(jié)合計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,不僅可以觀察固定的細(xì)胞,組織切片還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu),分子,離子進(jìn)行實(shí)時動態(tài)地觀察和檢測。


工作原理

下圖所示為激光熒光共聚焦顯微鏡的光路圖,輸出激光通過照明針孔再經(jīng)由分色鏡反射到物鏡,最后聚焦到樣品表面,激光會與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光,部分熒光信號會沿著入射光路相反方向通過物鏡后進(jìn)入二向色鏡(Beam Splitter),最終被探測器收集。由于針孔與樣品的焦平面處形成共軛關(guān)系,所以焦平面以外的反射信號會被針孔濾除,使得共聚焦顯微鏡具有一定的層析能力。經(jīng)過針孔后的熒光信號具有較強(qiáng)的層析能力,同時由于光強(qiáng)較弱,需要使用靈敏度較高的光電探測器進(jìn)行探測。光電倍增管可以將熒光信號放大并轉(zhuǎn)換為電信號(光電探測器輸出的電信號強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比)然后傳輸給電腦,電腦通過特定的處理方法將電信號轉(zhuǎn)換成圖像信息。

共聚焦顯微鏡的構(gòu)成

激光器(Laser

配置四條激光通道(405nm488nm,561nm,638nm,波長可選)

二向色鏡(Dichromatic

二向色鏡作為一個濾光片(Filter)可將熒光中摻雜的激光分離出來,以便于熒光的后續(xù)處理。

XY掃描鏡組(Scanner

由一個或多個反射鏡組成的鏡組,用于引導(dǎo)聚焦后的激光在樣本上進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)(Pixel-by- pixel)和行對行(Line- to- line)的掃描。

針孔(Pinhole

用于提高共聚焦顯微鏡的層析能力,可濾除焦點(diǎn)以外的熒光信號。

應(yīng)用

如下圖所示,使用激光共聚焦顯微鏡對花粉進(jìn)行3D成像,激發(fā)光源為488納米激光,通過將一張張光學(xué)切片按順序重構(gòu)可以得到下圖所示的三維圖像。

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