激光熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置,可以利用可見(jiàn)光對(duì)熒光探針進(jìn)行激發(fā),再利用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞的圖像。激光熒光共聚焦顯微鏡不僅可以觀(guān)察固定的細(xì)胞、組織切片,還可以對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀(guān)察和檢測(cè)。
一.Z-STACK 三維構(gòu)建
激光熒光共聚焦顯微鏡采用的是類(lèi)似于連續(xù)斷層掃描的方法,即通過(guò)移動(dòng)Z軸獲得一張張連續(xù)的光學(xué)切片,通過(guò)計(jì)算機(jī)可以將這些光學(xué)切片重新組構(gòu)建成一張三維圖像(可做單色或多色圖像處理組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu))。通過(guò)旋轉(zhuǎn),可觀(guān)察細(xì)胞各個(gè)側(cè)面的表面形態(tài),也可以從斷面觀(guān)察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu),測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)寬高,體積,細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)等功能。通過(guò)shadow功能,可以去除細(xì)胞上的陰影,突出細(xì)胞的立體效果。LSCM的Z-STACK廣泛應(yīng)用于細(xì)胞骨架,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞器等的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析中。
二. 細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè),原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子觀(guān)察
1.檢測(cè)細(xì)胞凋亡
2.細(xì)胞原位檢測(cè)核酸
細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀(guān)察,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀(guān)察
3.細(xì)胞器觀(guān)察及測(cè)定
4.觀(guān)察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)
5.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪
6.檢測(cè)細(xì)胞融合
三.動(dòng)態(tài)觀(guān)察
1.實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化
2.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PH的變化
激光共聚焦顯微鏡是測(cè)量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具,對(duì)焦點(diǎn)信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。利用熒光探針,可測(cè)量單個(gè)細(xì)胞內(nèi)PH和多種離子(Ca+,K+,Na+,Mg2+)在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。一般來(lái)說(shuō),電生理記錄裝置加攝像技術(shù)可以快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化,激光共聚焦技術(shù)可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Ca+濃度的動(dòng)態(tài)變化圖像,對(duì)研究Ca+細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。
3.檢測(cè)膜電位的變化
JC-1 低電位下單體存在,發(fā)綠色的熒光,高電位下J-聚集體發(fā)紅色的熒光,隨電位增加,紅色熒光也增加。
4.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生
5.藥物篩選
對(duì)藥物,病毒,細(xì)菌等進(jìn)行熒光標(biāo)記,當(dāng)檢測(cè)藥物跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞中時(shí),可檢測(cè)藥物是否進(jìn)入,位置含量以及動(dòng)態(tài)過(guò)程。
6.細(xì)胞間的通訊研究
激光共聚焦顯微鏡可通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來(lái)測(cè)量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子,小分子物質(zhì)。該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)育,生殖發(fā)育,神經(jīng)生物學(xué),腫瘤發(fā)生等過(guò)程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用,也可以用于鑒別對(duì)縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
7.觀(guān)察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)
LSCM已經(jīng)極大地提高了光子產(chǎn)生效率,樣品可以與更小毒性的染料結(jié)合減少每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷,可用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)程定時(shí)掃描,記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。
8.檢測(cè)熒光漂白的恢復(fù)
當(dāng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅失去發(fā)光能力,臨近細(xì)胞中未被淬滅的熒光分子可以通過(guò)細(xì)胞間的縫隙擴(kuò)散到已經(jīng)被漂白的細(xì)胞中,從而恢復(fù)熒光。該技術(shù)可用于分析分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸,受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。
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