干貨 | 你對(duì)“全能選手”DNase I 了解多少？
脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I），是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA的非特異性核酸內(nèi)切酶。它能夠水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有5'-磷酸基團(tuán)和3'-OH基團(tuán)的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。DNase I最佳的工作pH范圍是7-8，其活性依賴于Ca2+，并可被二價(jià)金屬離子如Mn2+，Mg2+，Zn2+等激活。在Mg2+存在條件下，DNase I 隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；Mn2+存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。
圖1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖常見的DNase I主要從牛胰腺中純化或?yàn)橹亟M酶。與從牛胰腺中純化的DNase I相比，重組酶來源的內(nèi)源性RNase水平相對(duì)較低或者能夠制備成無RNase產(chǎn)品形式，更適合對(duì)RNase敏感的應(yīng)用，如從RNA樣品中去除DNA。提到應(yīng)用，DNase I除了大家熟知的用于維護(hù)RNA完整性相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如提取不含DNA的RNA，反轉(zhuǎn)錄前制備無gDNA的RNA模板以及體外轉(zhuǎn)錄后降解DNA模板外，還可用于rRNA去除中消化DNA探針，缺口平移進(jìn)行DNA標(biāo)記，足跡法分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用，生成隨機(jī)的DNA文庫，減少細(xì)胞裂解物或蛋白提取物的粘性，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中作為添加物來消化細(xì)胞間的粘連，在細(xì)胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對(duì)照等。綜上所述，DNase I幾乎可用于任何需要酶切DNA的應(yīng)用中。下面小編簡單介紹幾種常見的應(yīng)用。RNA作為實(shí)驗(yàn)室常研究的樣本，其質(zhì)量的高低很大程度上會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。一般在RNA提取過程中無法*避免gDNA殘留，因此，在進(jìn)行具有挑戰(zhàn)性的下游應(yīng)用（例如mRNA表達(dá)量分析，轉(zhuǎn)錄組分析等）之前，通常建議對(duì)RNA樣本進(jìn)行DNase I處理，消化殘留的gDNA。消化gDNA步驟可以在RNA提取期間、RNA提取后或者RNA反轉(zhuǎn)錄之前進(jìn)行。表1：RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除DNA相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| TRIeasyTM 總RNA提取試劑（同Trizol） | |
| MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 | |
| MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | |
| MolPure® Viral DNA/RNA Kit 病毒DNA/RNA提取試劑盒 | |
| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
| Hifair® Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | |
| Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | |
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| Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶 | |
| Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒 | |
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| Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit | |
| UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade（50 U/μL） | |
| T7 RNA polymerase (50 U/μL) | |
| NTP Set Solution (ATP, CTP, UTP, GTP, 100 mM each） | |
| UCF.ME® Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade | |
| UCF.ME® Murine RNase inhibitor GMP-grade | |
| UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade | |
| UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade | |
| UCF.ME® mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase GMP-grade | |
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| S-adenosylmethionine (SAM)（32mM） | |
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1.提取Total RNA；
2.單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結(jié)合（注：需要設(shè)計(jì)與合成rRNA 特異性單鏈 DNA 探針）；
3.RNase H降解雜交的rRNA；
4.DNase I降解DNA 探針；
5.rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。
表3：rRNA去除相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(人/小鼠/大鼠) | |
| Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Plant) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(植物) | |
| Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit （rRNA & ITS/ETS） MaxUp核糖體RNA去除試劑盒（Human rRNA&ITS/ETS） | |
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| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
1.先用適宜濃度的DNase I在待標(biāo)記的雙鏈DNA的每一條鏈上產(chǎn)生若干個(gè)單鏈缺口，缺口處形成3’羥基末端。
2.再用E.coli DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性從缺口處5’端切除一個(gè)核苷酸，同時(shí)E.coli DNA Polymerase I的5’→3’聚合酶活性將一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸引入到缺口的3'端，以修補(bǔ)缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動(dòng)，標(biāo)記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。
圖4：缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記的原理示意圖表4：缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas | |
| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
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DNase I 足跡法分析實(shí)驗(yàn)
DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)是一種精確鑒定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點(diǎn)的檢測方法。其原理是蛋白結(jié)合在DNA片段上，能保護(hù)結(jié)合部位不被DNase I破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段（即“足跡”)，進(jìn)而可以確定其序列。在凝膠圖片中，相應(yīng)與蛋白結(jié)合的部位沒有條帶。1.將待檢雙鏈DNA分子進(jìn)行單鏈末端標(biāo)記。
2.將蛋白質(zhì)和DNA混合后，加入適量的DNase I進(jìn)行酶切，形成不同長度的DNA片段。該過程需要控制酶的用量，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個(gè)核苷酸，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對(duì)照。
3.從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA用PAGE電泳分離，放射自顯影，與對(duì)照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。
常見應(yīng)用：轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白通過與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)實(shí)驗(yàn)：凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）。EMSA可以確定蛋白是否與DNA直接結(jié)合，而DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)則可以精確鑒定其結(jié)合的DNA序列。
圖5：DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)原理圖【1】 | | |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas 脫氧核糖核酸酶I，來源于牛胰腺（CAT#10607，10608） | | 主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究: 從蛋白制備物中去除 DNA。 |
| Recombinant DNase I (RNase-free)（CAT#10325） | | 適用于各種應(yīng)用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對(duì)RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)樣品制備。 |
| UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade（CAT#10611） | 無RNase殘留，GMP藥用級(jí)別。采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。 | 適用于各種應(yīng)用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對(duì)RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)樣品制備。 |
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