RNA提取試劑盒用于從細(xì)胞、組織、新鮮血液和病毒中提取200bp及以下的smallRNA,用LB10裂解樣品后,加入氯仿,溶液分為無(wú)色水相和粉紅色有機(jī)相,RNA在水相中;用RNA硅膠膜離心柱特異地吸附水相中的大分子量RNA(28SrRNA,18SrRNA,mRNA),流出液中的smallRNA用miRNA硅膠膜離心柱特異地吸附。與其它miRNA提取方法相比,該試劑盒裂解能力強(qiáng)、提取量高、專(zhuān)一性強(qiáng),應(yīng)用范圍廣。
RNA提取試劑盒的提取步驟:
1、將處理后的樣品在室溫靜置5~10分鐘,使得核酸蛋白復(fù)合物*分離。
2、可選步驟:在4°C12,000rpm離心10分鐘,取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNasefree的離心管中。(當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉、脂肪組織或植物的塊莖部分時(shí)可能需要額外的分離步驟。)
3、每1ml裂解液RL加200μl氯仿。蓋緊樣品管蓋,劇烈振蕩15秒并將其在室溫下靜置3分鐘。
4、4°C12,000rpm離心10分鐘,樣品會(huì)分成三層:下層有機(jī)相,中間層和上清水相層,RNA存在于上清水相層中。
5、將上清水相轉(zhuǎn)入新的離心管中,加入0.5倍上清水相體積的無(wú)水乙醇,立即吹打混勻。(不要吸取、沉淀物和漂浮物。漂浮物可能會(huì)黏附在槍頭的外壁,注意不能將其帶入離心管中。)
6、將混合溶液(每次小于700μl,)轉(zhuǎn)入套有吸附柱AC的離心管中,12,000rpm離心45秒,棄掉廢液。
7、加500μl去蛋白液RE,12,000rpm離心45秒,棄掉廢液。
8、加500μl漂洗液RW(請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),12,000rpm離心45秒,棄掉廢液。
9、重復(fù)步驟8一次。
10、將吸附柱RA放回收集管中,13,000rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
11、取出吸附柱RA(避免吸附柱RA的底部碰到收集管里面的廢液),放入新的RNase-free離心管中,在吸附膜的中間部位加50~80μlRNase-freeH2O,室溫靜置2分鐘,12,000rpm離心1分鐘。洗脫后的RNA可立即使用或保存在-80°C。
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