——Protein A /G 瓊脂糖或磁珠

Protein A、Protein G是最常應(yīng)用于抗體親和純化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G瓊脂糖或磁珠將Protein A、G共價(jià)偶聯(lián)到介質(zhì)表面，具有結(jié)合能力更強(qiáng)、結(jié)合范圍更廣、實(shí)用性更高的特點(diǎn)。

1、純化抗體：一步純化即可從血清或腹水樣品中分離出高純度的抗體。

2、免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：通過對某蛋白質(zhì)的富集，研究該蛋白的特性（如翻譯后修飾等）。

3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation)：通過對某蛋白質(zhì)的富集，研究與其結(jié)合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白復(fù)合物等）。

1、Protein A/G 4FF Agarose純化兔血清中的抗體。

圖1 Protein A/G 4FF Agarose純化抗體結(jié)果電泳圖

2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，為了進(jìn)一步闡明Atuveciclib在IL-1b誘導(dǎo)的基質(zhì)降解中的作用。研究人員在IL-1b刺激30 min前，先利用Atuveciclib預(yù)處理人和大鼠NP細(xì)胞2h，然后使用針對p65和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9（CDK9）的特異性抗體對提取的總細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， IL-1b刺激增強(qiáng)了p65和CDK9之間的相互作用，而Atuveciclib減弱了這種作用。

Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.

1、Co-IP背景較深或者條帶雜亂

● 固相基質(zhì)的非特異性結(jié)合

● 抗體結(jié)合非特異的蛋白

● 洗滌不當(dāng)造成雜帶

● 建議方案：pre clear或者更換磁珠；設(shè)置對照排除非特異性條帶；優(yōu)化緩沖液

2、Input條帶清晰，co-IP條帶很弱？

設(shè)X為誘餌蛋白，Y為靶蛋白，有可能為

● X和Y的相互作用本身比較弱

● X蛋白并不是Y的，只部分Y與X互作

● 可以嘗試反向拉，比如用Y去拉X，可能效果比較好

3、我的蛋白正好和抗體重鏈分子量接近，要如何減少抗體干擾？

● IP/WB一抗使用不同種屬來源，選擇與IP抗體種屬無交叉反應(yīng)的二抗(Cross Adsorbed secondary antibody)

● 特殊二抗：比如僅識別重鏈或者輕鏈的二抗，或者僅識別天然抗體的二抗

● 直接源頭遏制：將抗體直接交聯(lián)到bead上，或者將抗體交聯(lián)到protein A/G上，避免洗脫干擾 

4、靶蛋白沒有條帶

● 裂解液不合適，或者沒有添加抑制劑，導(dǎo)致靶蛋白或者餌蛋白構(gòu)象改變不能結(jié)合或者降解

● 餌蛋白較難洗脫，換成高強(qiáng)度的洗脫緩沖液

● 選用的抗體不合適，建議IP驗(yàn)證過的抗體，并優(yōu)化下抗體用量

● 蛋白間為弱相互作用，或者相互作用依賴翻譯后修飾

5、瓊脂糖難離心，每次總會吸上來一點(diǎn)兒 

● 使用帶濾膜的離心柱，下部有接樣管，瓊脂糖*截留在濾膜上 

● 換成磁珠

6、我的目的蛋白因?yàn)闆]有對應(yīng)的特異性抗體而無法進(jìn)行免疫沉淀

● 若此蛋白帶標(biāo)簽，可選擇針對此蛋白的標(biāo)簽抗體來進(jìn)行免疫沉淀。

文獻(xiàn)引用

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[3] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412.      IF：3.537

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經(jīng)典文章分享：抗體親和純化系列——抗體純化，若有選擇，必是