截至2020年，全球共有76個多肽類藥物被批準上市，7000多個活性多肽被發(fā)現(xiàn)，約150個多肽藥物進入臨床試驗，在過去20多年中，平均每年被批準的多肽藥物約3個。微球、脂質(zhì)體、聚乙二醇（PEG）修飾等方法的深入應(yīng)用解決了多肽藥物穩(wěn)定性差、體內(nèi)易降解、半衰期短等成藥性差的問題，促進了多肽藥物的開發(fā)利用。多肽藥物藥效廣泛，臨床上以慢性病治療為主，例如罕見病、腫瘤、糖尿病、胃腸道、骨科、免疫、心血管疾病等。國內(nèi)外藥典將合成多肽類藥物列入化藥的范疇進行雜質(zhì)的控制。歐洲藥典規(guī)定合成多肽含量在0.5%以上的相關(guān)雜質(zhì)需進行定性分析，對含量在1%以上的相關(guān)雜質(zhì)進行定量分析并考察其毒副作用。2007年國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，指出合成多肽原料藥中工藝雜質(zhì)的來源和一般化學(xué)藥物有所不同，其可能的工藝雜質(zhì)如：缺失肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不*脫保護所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對映異構(gòu)的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性試劑和溶劑等。

多肽含有二硫鍵、裸露的氨基和羧基，容易因分子間二硫鍵或氨基羧基間脫水形成共價聚合物。共價鍵形成的聚合物雜質(zhì)可能存在較大免疫原性風險，在多肽類藥物制劑質(zhì)量研究和新藥申報中應(yīng)予以重點關(guān)注。質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析和氨基酸序列測定是合成多肽藥物及雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證最常用的技術(shù)手段。

島津解決方案

● 分析儀器

島津液相系統(tǒng)Nexera LC-40 +高分辨質(zhì)譜儀LCMS-9030

●  分析條件

流動相為水：乙腈：TFA=60:40:0.2

流速：0.5 mL/min等度洗脫

柱溫：25℃

質(zhì)譜：離子源：ESI（+）掃描范圍：m/z 100 ~5000

多肽藥物應(yīng)用案例一STN聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

圖1. 注射用STN破壞樣品HPLC色譜圖

（UV 210 nm）

圖2. STN聚合物雜質(zhì)可能的聚合方式

通過STN聚合物雜質(zhì)精確質(zhì)量數(shù)預(yù)測其分子式，結(jié)合多肽的質(zhì)譜峰歸屬對STN聚合物雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)推測（如圖2）。STN結(jié)構(gòu)中含有一對二硫鍵，綜合判斷其聚合位點為分子間二硫鍵。

多肽藥物應(yīng)用案例二TJN聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

圖3. 注射用TJN破壞樣品HPLC色譜圖

（UV 214 nm）

圖4. TJN聚合物雜質(zhì)MS2質(zhì)譜圖

使用島津精確分子式預(yù)測工具Formula Predictor對TJN聚合物雜質(zhì)進行分子式預(yù)測，其分子式預(yù)測結(jié)果恰好相當于兩分子TJN脫水，因此推測其聚合位點為兩分子TJN的氨基端和羧基端縮合生成肽鍵。TJN為20肽，其游離氨基端為苯丙氨酸，游離羧基端為亮氨酸。結(jié)合TJN二聚體的推定氨基酸序列進行二級質(zhì)譜碎片歸屬，TJN聚合物MS2質(zhì)譜圖中識別出多種特征碎片。特別是y19和b21碎片的存在證明聚合位點為亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）縮合而成的肽鍵。

結(jié)論

隨著我國成為國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）成員國，藥品的技術(shù)標準逐步與國際接軌。同時隨著我國藥品一致性評價工作的全面開展，合成多肽藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定將面臨巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。島津公司采用尺寸排阻色譜法建立合成多肽藥物的聚合物分析方法，并通過高分辨質(zhì)譜LCMS-9030測定聚合物的準確質(zhì)量數(shù)推測其分子式，同時結(jié)合MS/MS特征碎片推測聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本文展示LCMS-9030在多肽藥物的兩種主要聚合方式（二硫鍵和肽鍵）鑒定中的應(yīng)用。島津液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜LCMS-9030具有高質(zhì)量準確度，高分辨率的性能優(yōu)勢，是合成多肽藥物雜質(zhì)一級結(jié)構(gòu)鑒定的強有力工具。

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