腫瘤治療過程中，對治療反應(yīng)的預(yù)測可能對治療選擇和優(yōu)化其遞送參數(shù)中起到關(guān)鍵作用。來自俄羅斯和加拿大的研究人員M. A. sirotkina等將光學(xué)相干血管造影術(shù)（OCA）作為成像方法，使用小鼠耳移植腫瘤模型（CT-26）進(jìn)行了臨床前試驗(yàn)，觀察正常和病理灌注血管，并監(jiān)測了血管經(jīng)靶向光動力療法（PDT）后的治療反應(yīng)。還提出了一種穩(wěn)定簡單的以微血管作為度量的方法，即PDT后t = 24h，腫瘤和腫瘤周圍區(qū)域的灌注血管密度（PVD），用以判斷PDT的成功。同時經(jīng)組織學(xué)驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了OCA微血管度量的出色早期預(yù)測能力，以及腫瘤周圍微血管在決定長期PDT反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

  背景

 光動力療法（photodynamic therapy, PDT）是光照治療的一種，它憑借創(chuàng)傷小、毒副作用小、選擇性好、可重復(fù)性好、可保護(hù)容貌及重要器官功能等優(yōu)點(diǎn)，日漸成為一種頗具前景的腫瘤治療手段，尤其是小實(shí)體腫瘤。光動力療法的作用機(jī)制是光敏劑分子被光活化，在良好的組織血液供應(yīng)和氧合條件下形成單線態(tài)氧及其他活性氧類物質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡。其中，光敏劑在癌癥區(qū)域的吸收、激發(fā)光的3D空間分布、以及受照射組織中的氧張力都會影響PDT治療效率，因此需要對這三個因素進(jìn)行適當(dāng)控制以確保治療效果。但臨床條件下，這些參數(shù)隨時空變化顯著，很難控制，從而也很難預(yù)測PDT在個體中的療效。

 鑒于此，研究人員提出了各種治療計(jì)劃、劑量測定、監(jiān)測和反饋策略來優(yōu)化和改善PTD的效果。已經(jīng)有研究通過單線態(tài)氧發(fā)光或光敏劑光漂白檢測來測定PDT劑量，單線態(tài)氧發(fā)光法高靈敏度且可以直接檢測，但由于技術(shù)復(fù)雜及自身局限性導(dǎo)致無法在臨床得到廣泛應(yīng)用。而基于光敏劑光漂白的劑量測定法得到的結(jié)果，似乎與長期臨床結(jié)果聯(lián)系不大。

 已知微血管系統(tǒng)是組織供氧的手段，也是光動力療法的潛在靶點(diǎn)，因此血管造影成像可能為監(jiān)測PDT反應(yīng)提供一種途徑。光學(xué)相干斷層掃描（OCT）具有出色的3D空間分辨率、成像速度快且無創(chuàng)，能以多種無造影方式檢測血液微循環(huán)。已經(jīng)開發(fā)的各種OCT血管成像方法包括Doppler OCT, speckle variance OCT和phase variance OCT，在微血管探測率、對大塊組織運(yùn)動穩(wěn)定性、血管陰影偽影、血流檢測與微血管網(wǎng)絡(luò)可視化等方面都有相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)。本研究采用光學(xué)相干血管造影術(shù)（optical coherence angiography, OCA）能夠?qū)α鲃友汗嘧⒌幕钴S微血管進(jìn)行靈敏3D檢測，提供顯微結(jié)構(gòu)和功能性微循環(huán)圖像，這對于監(jiān)測PDT過程中的灌注情況非常重要。結(jié)合臨床前和臨床研究，證明用OCA對血液灌注反應(yīng)監(jiān)測，可在抗腫瘤治療監(jiān)測和結(jié)果評估中發(fā)揮潛在用途。

 已知在治療期間和/或治療后不久（約幾小時），監(jiān)測腫瘤血管的損傷情況，可能會幫助預(yù)測出腫瘤對PDT的最終反應(yīng)。在之前的耳腫瘤模型研究中，研究人員得出了一個簡單方便的判斷PDT有效性的標(biāo)準(zhǔn)，即PDT后24小時，OCA圖像上沒有灌注血管。但由于數(shù)據(jù)量較少（n = 11）且標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，造成有20%的假陽性率，此外也沒有研究PDT對腫瘤周圍微血管的損害。事實(shí)上，如果PDT沒有如期破壞掉腫瘤周圍組織中起供應(yīng)作用的脈管系統(tǒng)，腫瘤就沒有被治愈，并可能復(fù)發(fā)，因此有必要在大量樣本中，對腫瘤和腫瘤周圍血液灌注中的PDT效應(yīng)進(jìn)行更全面的研究。

 研究人員在接種了CT-26鼠結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系的臨床前小鼠耳模型（n = 31）中，使用OCA對PDT治療情況進(jìn)行了監(jiān)測。有意選擇“溫和”的PDT照射方案，以獲得有反應(yīng)者和無反應(yīng)者的一系列結(jié)果。根據(jù)PDT后幾個時間點(diǎn)（0-24h）OCA對腫瘤及腫瘤周圍組織的監(jiān)測，來預(yù)測治療結(jié)果，并將預(yù)測結(jié)果與治療后7天組織學(xué)顯示的治療結(jié)果相關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從t = 24h的OCA圖像得出的微血管指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確區(qū)分出有無應(yīng)答。

  結(jié)果

 基于OCA的PDT結(jié)果評估所用的可控腫瘤模型

 對比正常組織和腫瘤組織的OCA圖像，血管結(jié)構(gòu)存在顯著差異。腫瘤脈管系統(tǒng)中由于活躍的新血管形成和血管發(fā)生，比腫瘤周圍組織脈管系統(tǒng)更密集，且扭曲度更高（圖1a，b）。

圖1 用于OCA觀察的小鼠耳模型中，灌注的微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。（a）3D OCA數(shù)據(jù)的2D投影，為正常耳朵微循環(huán)；（b）在小鼠耳朵中生長的CT-26腫瘤的OCA圖像（腫瘤細(xì)胞接種后兩周）；（c，d）小鼠耳朵的照片。黑色虛線為OCA成像區(qū)域，2.5 × 2.5 mm²。
 

 01-腫瘤及腫瘤周圍PDT效果的OCA可視化

 圖2a為PDT前，腫瘤及腫瘤周圍灌注微血管的OCA成像。在PDT后幾個時間點(diǎn)（即刻、t = 5h、t = 24h）進(jìn)行OCA成像，并在t = 24h檢測到腫瘤及腫瘤周圍組織中發(fā)生zuimingxian的血管反應(yīng)。圖2b表明腫瘤部位無灌注血管，且腫瘤周圍組織中灌注血管密度（PVD）非常低，二者同時出現(xiàn)可能表明PDT治療成功，即有應(yīng)答。此外有些動物腫瘤本身中沒有灌注血管，但是腫瘤周圍組織中可見的一些有活力的灌注血管（圖2c），隨后證明是無應(yīng)答。
 

圖2 PDT后t = 24h腫瘤及腫瘤周圍，灌注微血管的OCA圖像。（a）PDT前。（b）有應(yīng)答的OCA實(shí)例：腫瘤內(nèi)無可見灌注血管，腫瘤周圍組織PVD極低。（c）無應(yīng)答的OCA實(shí)例：腫瘤內(nèi)無灌注血管，但腫瘤周圍組織有許多灌注血管。虛線處為腫瘤邊界。

  02-對OCA圖像量化以用于PDT結(jié)果預(yù)測

 對獲得的3D微血管灌注圖譜進(jìn)行量化和分析，以獲得用以準(zhǔn)確預(yù)測PDT結(jié)果的OCA源標(biāo)志物。首先檢查PDT前的數(shù)據(jù)，在31個樣本中，根據(jù)PDT前的腫瘤PVD可產(chǎn)生20個正確預(yù)測結(jié)果（準(zhǔn)確率70%，威爾遜區(qū)間=48-75%）。根據(jù)腫瘤周圍組織PVD可產(chǎn)生18個正確預(yù)測結(jié)果（準(zhǔn)確率58%，威爾遜區(qū)間=42-74%）。因此，PDT治療前的微血管灌注狀態(tài)似乎不能用于可靠預(yù)測PDT反應(yīng)。當(dāng)加入PDT后的數(shù)據(jù)，OCA預(yù)測精度提高了（圖3c）。統(tǒng)計(jì)了PDT后三個時間點(diǎn)（即刻、t = 5h、t = 24h）的正確預(yù)測結(jié)果（CPO），總結(jié)在表1中。

 

圖3 治療后OCA衍生的PVD變化，用于預(yù)測PDT是否成功。（a）腫瘤中PVD隨時間變化情況。（b）腫瘤周圍組織中PVD隨時間變化情況。（c）PDT治療后，三個時間點(diǎn)中，基于PVD值的正確預(yù)測結(jié)果的百分比。



 

表1 在不同時間點(diǎn)，根據(jù)腫瘤及腫瘤周圍PVD得到的，正確預(yù)測結(jié)果（CPO行）、相應(yīng)的置信區(qū)間（CI行）、用于區(qū)分有應(yīng)答和無應(yīng)答者的PVD值閾值（PVD閾值行）的匯總。

 根據(jù)數(shù)據(jù)可以得出幾個判斷，首先證實(shí)了研究人員之前的觀察結(jié)果，即只有無應(yīng)答的腫瘤OCA圖像上有灌注血管（PDT后t = 24h）。因此，如果在腫瘤區(qū)域內(nèi)觀察到有任何灌注血管，則認(rèn)為PDT不成功（圖3a）。然而反過來，治療后腫瘤內(nèi)的灌注血管并不都是缺失的，是否有灌注血管不能預(yù)測PDT的結(jié)果。本研究中13例無應(yīng)答中有8例在PDT后t = 24h時腫瘤內(nèi)沒有灌注血管。其次從表1中不斷增加的CPO可以看出，PDT后經(jīng)過的時間越長，預(yù)測精度越高。

 檢查t = 24h的數(shù)據(jù)，可注意到在有應(yīng)答樣本的腫瘤周圍組織中，PVD比PDT前下降了一個數(shù)量級（0.38±0.22 vs 3.14±0.57%）。相比之下，無應(yīng)答樣本的PVD略有減少（2.21±0.86% vs 3.29±0.59%）（圖3b）。根據(jù)這些趨勢可得出治療結(jié)果預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)的公式，閾值可設(shè)置為有應(yīng)答組中最高PVD值和無應(yīng)答組中zuidiPVD值之間的平均值，即本研究中閾值= 1%。使用該閾值根據(jù)t = 24h腫瘤周圍PVD的測量值，正確地預(yù)測了所有31例樣本的結(jié)果（準(zhǔn)確性= 100%，威爾遜區(qū)間=89–100%）。

 綜上所述，可以根據(jù)PDT后t = 24h的OCA可視化結(jié)果制定一個簡單易行的預(yù)測方案，即如果腫瘤內(nèi)的OCA圖像中有任何灌注血管，則認(rèn)為PDT不成功；如果腫瘤內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)灌注血管，則應(yīng)額外評估約2 mm附近的周圍組織，如果該區(qū)域灌注血管的總密度在OCA圖像上不超過1%，則可認(rèn)為PDT是成功的；偏離這個標(biāo)準(zhǔn)為無應(yīng)答。圖解總結(jié)見圖4。



 

圖4 基于OCA的PDT成功評估方案的圖解總結(jié)，基于治療后t = 24h的腫瘤及腫瘤周圍微血管反應(yīng)。
 03-組織學(xué)驗(yàn)證

 所有OCA檢查過的動物在PDT后7天接受組織學(xué)評估驗(yàn)證。研究人員根據(jù)之前的研究，將組織學(xué)上腫瘤總壞死率> 95%的劃分為有應(yīng)答（圖5a），將腫瘤壞死率< 95%劃分為無應(yīng)答（圖5d）。對于PDT有應(yīng)答樣本，腫瘤周圍區(qū)域，包括距腫瘤邊緣約2 mm的“正?！倍M織，都顯示缺血，并在組織學(xué)上可以清楚地看到壞死（圖5b，c）。對于無應(yīng)答樣本，PDT后7天，在腫瘤邊緣即約2 mm以外的腫瘤周圍組織都沒有損傷。有應(yīng)答和無應(yīng)答中均觀察到組織病理學(xué)可見的壞死受照射腫瘤組織，但部分可能是由于血管的血栓形成，這表明僅局部腫瘤反應(yīng)不足以預(yù)測治療結(jié)果，腫瘤周圍微血管系統(tǒng)也發(fā)揮關(guān)鍵作用。事實(shí)上，在PDT成功樣本中，距病理邊緣約2 mm的腫瘤周圍組織OCA上無灌注血管（t = 24h），有組織壞死（t = 7天）。

 無處理和僅光照的對照實(shí)驗(yàn)樣本在整個觀察期間，圖像上都顯示出發(fā)育良好的腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)，在研究結(jié)束時顯示出80-100%的活腫瘤細(xì)胞。



 

圖5 PDT后t = 7天治療結(jié)果的組織學(xué)評估。左側(cè)為有應(yīng)答。（a）腫瘤中心部分的總腫瘤壞死率（> 95%）。（b）距腫瘤邊緣約2 mm的“正?！倍M織（但仍在PDT治療范圍內(nèi)）*壞死。右側(cè)為無應(yīng)答。（c）部分腫瘤壞死（~75%）和活腫瘤區(qū)。（d）未受損的“正?！倍M織，距離腫瘤邊緣約2 mm（但仍在PDT治療范圍內(nèi)）。


 總結(jié)
 本研究提出了一個準(zhǔn)確早期（治療后24小時）預(yù)測PDT成功的標(biāo)準(zhǔn)：即在腫瘤邊界內(nèi)的OCA圖像中不應(yīng)有可見的灌注血管，并且在2 mm范圍內(nèi)的腫瘤附近區(qū)域，灌注血管密度不應(yīng)超過OCA圖像尺寸的1%。已有類似研究結(jié)果能與之匹配，如Kutsuyoshi等人證明了阻斷腫瘤及腫瘤周圍血液循環(huán)，在預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的臨床策略中具有很大的潛力。在未來的臨床應(yīng)用中，OCA成像可用于監(jiān)測腫瘤治療中PDT療效，以及時對治療方案進(jìn)行修正。
 

參考文獻(xiàn)：

Sirotkina, M. A. , et al. "Accurate early prediction of tumour response to PDT using optical coherence angiography." Scientific Reports 9.1(2019).