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迷迭香中的化學(xué)成分十分的復(fù)雜，目前研究比較多的抗氧化成分主要為迷迭香酚、表迷迭香酚、異迷迭香酚、迷迭香酸及黃酮等成分。熊果酸(Ursolic acid,UA)具有抗腫瘤、抗肝炎、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗HIV、抗寄生蟲等作用，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尚無合成品，主要靠從植物中提取獲得[5]。從迷迭香中提取熊果酸未見有關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑提取法對迷迭香中熊果酸的最佳提取工藝進(jìn)行了研究，同時(shí)采用高效液相色譜法準(zhǔn)確對提取物中熊果酸進(jìn)行定量，為充分利用迷迭香資源提供科學(xué)依據(jù)。
需要干制迷迭香，由中藥標(biāo)準(zhǔn)對照品研究中心提供;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品;甲醇為色譜純，水為超純水;無水乙醇、香草醛、高氯酸、乙酸均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠出品。高效液相色譜Jasco-1586(雙泵)，UV-1570紫外檢測器;CO-1560柱箱;LEO超聲波清洗器，大連華洋科技儀器有限公司產(chǎn)品;PPENDORF微量移液器(德國);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph LABOROTA 4000;UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，日本島津株式會(huì)社公司產(chǎn)品。
迷迭香中熊果酸的定性—高氯酸-香草醛法 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品4.7 mg，置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度，作為對照品溶液。用微量移液器移取對照品溶液1.00 ml于10 ml容量瓶中，于100℃烘箱中烘干后，冷卻后加入0.5 ml 5%香草醛和0.8 ml高氯酸，在60℃水浴保溫10 min，冷卻后加乙酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，在546 nm處測定吸光度。
含量測定： 高效液相色譜法測定條件 色譜條件：色譜柱為Symmetryshield RP18 (3.9 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為0.2%磷酸二氫鈉-甲醇(14∶86);流速為0.8 ml/min;檢測波長為210 nm;靈敏度為0.16 AFUS;柱溫為室溫(25 ℃)。供試品溶液的制備 稱取迷迭香粉末適量，按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表所列進(jìn)行提取，提取過程保持溶劑回流狀態(tài)，過濾或抽濾除渣，減壓回收乙醇，得浸膏，將浸膏依次用石油醚、氫氧化鈉水溶液、水洗至洗出液近無色，烘干。再用無水乙醇加熱溶解，加活性炭回流脫色，過濾。用熱乙醇反復(fù)洗滌殘?jiān)喜V液及洗液，蒸去部分乙醇，放冷，靜置，得白色片狀結(jié)晶提取物。精密稱取提取物100.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。測定 吸取上述對照品溶液和供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μl進(jìn)行分析，根據(jù)HPLC色譜圖中的峰面積，按外標(biāo)法定量，計(jì)算出樣品中熊果酸的含量和提取率。
單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：提取溶劑的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用甲醇、乙醇、醋酸乙酯、丙酮作溶劑，以1∶25的料液比，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。由表1可以看出最佳的提取溶劑是乙醇。雖然丙酮的吸光度較大，但因?yàn)楸卸?，生產(chǎn)工藝要求較高，所以不選擇丙酮作提取溶劑。表1 不同提取溶劑對提取效果的影響。②乙醇濃度的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇50 ml，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。從表2可以看出隨著乙醇濃度的增加，提取物的吸光度逐漸升高，說明提取出來的熊果酸在增加。其可能原因是隨著乙醇濃度的增大，乙醇溶液的極性也逐步減弱，而熊果酸又屬于五環(huán)三萜類非極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，熊果酸易溶于純的乙醇溶液中。為了回收溶劑方便，選擇乙醇的最佳提取濃度為90%。③料液比的選擇稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇分別配制1∶10，1∶15，1∶20，1∶25料液比(g/ml)，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測定。結(jié)果見表3。表2 乙醇濃度對提取效果的影響表3 物料比對提取效果的影響從表3可見，隨著溶劑量的增加，提取物的吸光度逐漸升高，到20倍量以后基本持平。由于料液比增加，會(huì)給后處理工序增加困難，而且增加生產(chǎn)成本，在保證提取效果的同時(shí)，應(yīng)盡量減少溶劑用量和降低蒸發(fā)濃縮負(fù)荷，因此選擇最佳料液比為1∶20。④提取時(shí)間的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇溶液，以1∶20的料液比，在60℃水浴中提取1，2，3，4，8 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測定。結(jié)果見表4。表4 提取時(shí)間對提取效果的影響⑤ 提取溫度的選擇 稱取迷迭香2 g，用90%乙醇溶液為溶劑，以1∶20的料液比，在55，60，65，70，75，80，90℃水浴中提取4 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測定。
隨著溫度的升高，溶劑的粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，浸提液的擴(kuò)散系數(shù)增加，促使浸提速度加快。從表5可以看出，隨著溫度的提高提取物的吸光度也平緩增加，到90℃吸光度下降，可能是因?yàn)橐掖荚?0℃左右沸騰，在接近沸點(diǎn)時(shí)提取溫度太高，雜質(zhì)的溶出量增加而受到影響。所以最佳的提取溫度為80℃。
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析以不同提取工藝條件下迷迭香中熊果酸的含量為指標(biāo)，以單因素各影響因子為研究對象，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表6。表6的結(jié)果說明，各因素對迷迭香酸提取效果的影響程度依次為B>A>D>C，因素C、D無顯著性差異，這說明提取溫度和提取時(shí)間在正交設(shè)計(jì)的4水平內(nèi)對迷迭香酸的含量無顯著性影響，而提取時(shí)間太長會(huì)延長操作周期，對生產(chǎn)不利。因素A、B有顯著性差異，說明料液比和乙醇濃度對迷迭香酸的含量有很大的影響，綜合各因素的k值和直接比較，A3B3C2D1為最佳提取條件。即料液比1∶20，溶劑比為90%的乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時(shí)間3h。表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
提取次數(shù)的選擇通過正交實(shí)驗(yàn)得到一個(gè)最佳提取工藝條件的組合，按此組合，分別提取1，2，3，4次，以迷迭香酸的提取率為檢測指標(biāo)，考察提取次數(shù)對提取工藝的影響，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次，結(jié)果見表7。從表7可以看出，2次提取就可將大部分迷迭香酸提出，提取率達(dá)92.38%，再增加提取次數(shù)，提取率提高不明顯。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，本實(shí)驗(yàn)采用2次提取。表7 浸提次數(shù)對提取率的影響結(jié)合單因素和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得出迷迭香中熊果酸酸的最佳提取工藝是：料液比1∶20，溶劑比為90%的乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時(shí)間3 h，浸提兩次。在最佳條件下熊果酸的提取率為92.38%。相關(guān)文章：熊果酸中藥標(biāo)準(zhǔn)品在植物中提取工藝的方法
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