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正畸壓應(yīng)力促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的機(jī)制研究

來源:上海泉眾機(jī)電科技有限公司   2022年05月23日 09:36  

在正畸治療期間,對牙齒施加機(jī)械力,導(dǎo)致牙槽骨的持續(xù)重塑。破骨細(xì)胞在壓力側(cè)移除舊骨,而成骨細(xì)胞在張力側(cè)形成新骨。在機(jī)械力誘導(dǎo)的骨重塑過程中,細(xì)胞骨架發(fā)揮著重要作用,將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號,然后化學(xué)信號再轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中,調(diào)節(jié)分化、增殖、遷移和其他細(xì)胞過程。


據(jù)報(bào)道,多種信號通路參與成骨細(xì)胞的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Jun 氨基末端激酶、粘著斑激酶和 STAT3/Girdin/Akt 通路。相比之下,破骨細(xì)胞中的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在很大程度上尚未探索,因?yàn)槠乒羌?xì)胞是分化細(xì)胞,壽命短,仍然沒有穩(wěn)定的破骨細(xì)胞系。NF-κB 受體激活劑配體(RANKL)對于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞激活和分化為破骨細(xì)胞至關(guān)重要。然而,尚不清楚機(jī)械力如何調(diào)節(jié)信號通路以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化和融合成破骨細(xì)胞。


侵襲性偽足是一種富含肌動蛋白的膜突出物,能夠介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的局灶降解,在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用。在破骨細(xì)胞生成過程中,侵襲性偽足在破骨細(xì)胞融合中起關(guān)鍵作用,環(huán)狀侵襲偽足的形成和破骨細(xì)胞融合都依賴于 Tks5,這是一種具有 端 phox 同源結(jié)構(gòu)域(PX)的銜接蛋白,最初被確定為 Src 底物。


基于先前的研究,山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東大學(xué)口腔學(xué)院口腔正畸科、昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔正畸科的聯(lián)合課題組曾假設(shè)正畸壓縮力可能促進(jìn)環(huán)狀侵襲性偽足的形成以及破骨細(xì)胞前體與成熟破骨細(xì)胞的細(xì)胞間融合。這項(xiàng)研究旨在檢驗(yàn)假設(shè)并探索正畸壓縮力促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟的潛在信號機(jī)制。實(shí)驗(yàn)使用源自 Balb/c 小鼠的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,研究正畸壓縮力對這些細(xì)胞中侵襲性偽足形成和細(xì)胞-細(xì)胞融合的影響。



壓力促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和侵襲偽足的形成

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色一直是鑒定破骨細(xì)胞的可靠方法,實(shí)驗(yàn)對受到壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行了 TRAP 染色。與未暴露于壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞相比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),暴露于壓應(yīng)力的細(xì)胞中 TRAP 陽性細(xì)胞的百分比顯著更高。這表明,壓應(yīng)力促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟。


此外檢測到,在受到壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中形成了侵襲性偽足。用 Tks5 和 F-肌動蛋白抗體進(jìn)行免疫染色顯示,在暴露于壓應(yīng)力下,Tks5 和 F-肌動蛋白在 RAW264.7 細(xì)胞延伸的侵襲性偽足中積累,并融合了多個(gè)細(xì)胞。定量分析表明,暴露于壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中具有環(huán)狀侵襲性偽足的細(xì)胞百分比顯著高于未施壓的細(xì)胞。這表明,壓應(yīng)力促進(jìn)了環(huán)狀侵襲性偽足的形成和細(xì)胞融合。


壓應(yīng)力上調(diào) Ets-1 和 Tks5 的表達(dá),促進(jìn) Ets-1 在 RAW264.7 細(xì)胞中的激活
接下來研究了壓縮應(yīng)力促進(jìn)環(huán)狀侵襲性偽足形成和細(xì)胞融合的分子信號機(jī)制。因?yàn)?nbsp;Tks5 是侵襲性偽足形成的主要調(diào)節(jié)因子,實(shí)驗(yàn)檢測了壓力對 Tks5 表達(dá)的影響。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示,與未施壓的細(xì)胞相比,在受到壓力的 RAW264.7 細(xì)胞中,Tks5 表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上調(diào)。此外,RT-PCR 分析顯示,與未施壓的細(xì)胞相比,在受到壓力的 RAW264.7 細(xì)胞中,Tks5 表達(dá)在 mRNA 水平上調(diào)。這表明,壓力在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了 Tks5 的表達(dá)。

為了確定負(fù)責(zé) Tks5 上調(diào)的潛在轉(zhuǎn)錄因子,隨后進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并預(yù)測 Ets-1 是驅(qū)動 Tks5 表達(dá)的候選轉(zhuǎn)錄因子。此外,先前的研究表明,壓縮力或剪切應(yīng)力誘導(dǎo) Ets-1 的上調(diào)和激活以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此,檢查了壓力對 Ets-1 的表達(dá)和激活(磷酸化)的影響。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示,與未施壓的細(xì)胞相比,在受到壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中,Ets-1 蛋白和在 Thr38 處磷酸化的 Ets-1 水平顯著增加。此外,PCR分析顯示,與未施壓的細(xì)胞相比,在受到壓應(yīng)力的RAW264.7細(xì)胞中,Ets- 1表達(dá)在mRNA水平上調(diào)。這表明,壓應(yīng)力激活 Ets-1 上調(diào) Tks5 表達(dá)。



Tks5 是 Ets-1 在 RAW264.7 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)

為了確認(rèn)壓應(yīng)力激活 Ets-1 以上調(diào) Tks5 表達(dá),實(shí)驗(yàn)用 Ets-1 過表達(dá)載體或 Ets-1 siRNA 轉(zhuǎn)染 RAW264.7 細(xì)胞,以在蛋白質(zhì)和 mRNA 水平上過表達(dá)或敲低 Ets-1。實(shí)驗(yàn)制作了包含 Tks5 野生型啟動子區(qū)域和突變啟動子區(qū)域的報(bào)告構(gòu)建體,其中預(yù)測的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)被刪除。

熒光素酶測定顯示 Ets-1 過表達(dá)導(dǎo)致 Tks5 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加,但這可以通過刪除 RAW264.7 細(xì)胞中 Tks5 啟動子中預(yù)測的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)來消除。此外,暴露于壓應(yīng)力顯著增加了 Tks5 野生型啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性,但不增加突變啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。然而,由壓應(yīng)力刺激的 Tks5 野生型啟動子區(qū)域增加的轉(zhuǎn)錄活性被 RAW264.7 細(xì)胞中 Ets-1 的敲低消除。總之,這表明 Tks5 在基本條件和壓應(yīng)力條件下都是 RAW264.7 細(xì)胞中 Ets-1 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。


壓應(yīng)力誘導(dǎo) Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和細(xì)胞融合依賴于 Ets-1

為了確認(rèn) Ets-1 對壓力誘導(dǎo)的 Tks5 上調(diào)、侵襲偽足形成和細(xì)胞融合至關(guān)重要,實(shí)驗(yàn)使用 Ets-1 shRNA 敲低 RAW264.7 細(xì)胞中的 Ets-1。基于免疫染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),壓縮應(yīng)力顯著增加了具有環(huán)狀侵襲偽足的 RAW264.7 細(xì)胞的百分比,敲低 Ets-1 顯著抑制了 RAW264.7 細(xì)胞在基本條件下和在壓縮應(yīng)力條件下環(huán)狀侵襲偽足的形成。此外,Ets-1 的敲低顯著抑制了 TRAP + 破骨細(xì)胞樣 RAW264.7 細(xì)胞在基本條件和壓縮應(yīng)力條件下的融合。這些結(jié)果表明 Ets-1 介導(dǎo)了壓應(yīng)力對 Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和破骨細(xì)胞融合的影響。


總之,該研究證明了 Ets-1 被壓縮應(yīng)力上調(diào),并且在壓縮應(yīng)力介導(dǎo) Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和破骨細(xì)胞融合的作用中至關(guān)重要。研究結(jié)果為正畸治療期間破骨細(xì)胞成熟和融合的機(jī)制提供了新的見解。


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圖1 壓縮應(yīng)力誘導(dǎo)破骨細(xì)胞侵襲偽足形成和細(xì)胞融合機(jī)制的示意圖。


這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),壓縮力誘導(dǎo)了 Tks5 的上調(diào),這可以解釋壓縮力如何促進(jìn)侵襲偽足的形成?;谶@些發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)模型來解釋壓縮力如何促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和融合。壓縮力誘導(dǎo) Ets-1 上調(diào)并導(dǎo)致 Ets-1 在 Thr38 位點(diǎn)磷酸化,接下來激活的 Ets-1 進(jìn)入細(xì)胞核識別 Tks5 基因啟動子區(qū)域中的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)并驅(qū)動 Tks5 的轉(zhuǎn)錄,然后 Tks5 促進(jìn)侵襲性偽足的形成和破骨細(xì)胞前體的融合。



參考文獻(xiàn):Wang Y, Zeng Z, Cheng Y, Zhao L, Yan Q, Qiu Y, Hu J, Guo J. Orthodontic compressive force modulates Ets-1/Tks5 pathway to promote the formation of circumferential invadopodia and the fusion of osteoclast precursors. J Cell Physiol. 2019 Aug;234(8):12685-12691. doi: 10.1002/jcp.27879. Epub 2018 Dec 6. PMID: 30523634.


圖片來源:所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)

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