微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

α-GC 分解對(duì)-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC 活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

充分混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變），8000g，4℃，離心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 2min 后， 400nm 處測(cè)定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-GC 活力計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 0.00585x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光

值。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y =  0.0039x  -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光

值。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。