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Ficoll密度梯度離心法提取PBMC原理及注意事項(xiàng)

來(lái)源:匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司   2022年06月29日 10:56  

外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞,包括淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)、單核細(xì)胞(Monocyte)、樹突狀細(xì)胞(DC)和其他少量細(xì)胞。PBMC可通過(guò)健康人或動(dòng)物供體的外周血,通過(guò)Ficoll密度梯度離心法(IPHASE/匯智和源),磁珠分選等步驟獲得。

  Ficoll是蔗糖的多聚體,中性,平均分子量400,000,當(dāng)密度為1.2g/mL,未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大,離心后沉于管底;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重,離心后漂浮于分層液的液面上,也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞,就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。

人PBMC中不同細(xì)胞類型的比例

PBMC中大部分都是淋巴細(xì)胞,包括B細(xì)胞和T細(xì)胞,其中CD3 T細(xì)胞又占了淋巴細(xì)胞中絕大部分(45-70%)。這些T細(xì)胞都處于初始(naive)狀態(tài),即已經(jīng)成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中,只有非常小的一部分初始T細(xì)胞會(huì)因抗原識(shí)別而被激活。同樣的B細(xì)胞也都處于初始狀態(tài)。相對(duì)于淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞的比例在10-30%,收到刺激之后會(huì)發(fā)育成樹突狀細(xì)胞(DC)或巨噬細(xì)胞。干細(xì)胞的比例非常低,只有0.1-0.2%,因此很難從全血樣本中分離到。

一、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)制備方法

1.設(shè)備與試劑

全血 (以10ml為例)

無(wú)菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水

蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) 

RPMI 1640培養(yǎng)基 

胎牛血清(FBS)

雙抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) 

二甲亞砜(DMSO)

預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒


2.方法/步驟

配制所需的溶液:

a. 細(xì)胞培養(yǎng)基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;

b. 細(xì)胞凍存液:FBS中加入10%DMSO;


(1)將10ml全血轉(zhuǎn)入50ml離心管中,加入10ml PBS溶液稀釋,輕輕混勻;

(2)取兩支15ml離心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層,一定要輕柔,避免兩種溶液混合在一起,每只離心管各10ml稀釋血液;

(3)2,000rpm,20min,注意,降速設(shè)置中一定要設(shè)置成no break,或者只有1-2成的制動(dòng)。離心完畢將得到如圖所示分層;

(4)PBMC所在細(xì)胞層為白色。此時(shí)可以用吸管將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。

(5)加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min離心后去掉上清,再加入培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗;

(6)加入5-10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)或者鋪板;

(7)細(xì)胞凍存:將細(xì)胞離心收集之后,用細(xì)胞凍存液重懸。取1-1.5ml細(xì)胞至凍存管中,放入凍存盒(凍存盒可事先在4℃冰箱預(yù)冷)。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過(guò)夜。第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

IPHASE/匯智和源建議操作注意事項(xiàng)

(1)全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層,但是最終都必須保證兩種溶液分層清晰。

(2)分離PBMC第一步離心的時(shí)候,一定不能設(shè)置或設(shè)置低水平的制動(dòng)。否則將分層混亂。

(3)人PBMC和動(dòng)物PBMC分離方法稍有不同,動(dòng)物PBMC需求可聯(lián)系IPHASE/匯智和源。


細(xì)胞運(yùn)輸與保存

(1)干冰運(yùn)輸,收到細(xì)胞后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇;

(2)T25瓶運(yùn)輸?shù)男迈r細(xì)胞,收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng),傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),再進(jìn)行凍存,具體操作步驟見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。


PBMC收到后注意事項(xiàng)

(1)收到PBMC細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)反饋。

(2)先不打開瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放培養(yǎng)箱靜置四小時(shí),穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),切忌在溫箱內(nèi)靜置過(guò)夜。

(3)靜置后鏡檢,拍照,記錄細(xì)胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

(4)貼壁細(xì)胞:若細(xì)胞密度超過(guò)80%,可正常傳代;若未超過(guò)80%,收集細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代,瓶蓋可稍微擰松。

(5)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗,可收集后4℃保存?zhèn)溆?,可補(bǔ)加2%血清。剛開始傳代時(shí)建議一半用細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,一半用自備的培養(yǎng)基,使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件,以免因不適應(yīng)而造成生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。

(6)細(xì)胞消化液建議使用PBS配制。


IPHASE/匯智和源其他外周血單個(gè)核細(xì)胞:

人外周血單個(gè)核細(xì)胞 Human PBMC

猴外周血單個(gè)核細(xì)胞 Monkey PBMC

比格犬外周血單個(gè)核細(xì)胞 Dog PBMC

大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞 Rat PBMC

小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞 Mouse PBMC

兔外周血單個(gè)核細(xì)胞 Rabbit PBMC

豬外周血單個(gè)核細(xì)胞 Pig PBMC


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