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卵黃抗體的作用與制備

來(lái)源:上海鹿森生物工程有限公司   2022年07月05日 09:03  

卵內(nèi)儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),主要由清蛋白、球蛋白、磷蛋白、卵磷脂及一些酶等組成,在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著積極作用。鳥(niǎo)類、兩棲類和大多數(shù)魚(yú)類的卵黃發(fā)生有兩種來(lái)源:一是由卵母細(xì)胞本身合成,稱內(nèi)源性卵黃;一是由卵母細(xì)胞以外的組織細(xì)胞合成,稱外源性卵黃,如脊椎動(dòng)物由肝臟合成卵黃前體,再輸送至卵巢,由卵母細(xì)胞攝入。 

作用

通過(guò)免疫注射產(chǎn)蛋雞,即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)的抗體,并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療,這類制劑稱為卵黃抗體。卵黃抗體在臨床上應(yīng)用較為廣泛,其優(yōu)點(diǎn)是雞蛋比動(dòng)物血清更容易獲得,且卵黃中抗體含量較高。禽類的免疫器官法氏囊主要控制機(jī)體的體液免疫,機(jī)體的免疫應(yīng)答發(fā)生后,體液中成熟的骨髓依賴性淋巴細(xì)胞受相關(guān)免疫信號(hào)通路的介導(dǎo),分化為漿細(xì)胞,隨即產(chǎn)生大量抗體釋放入血液中。血液中的大量抗體逐漸轉(zhuǎn)移入卵黃中,并適量地蓄積。收集到的卵黃抗體,即為通過(guò)同一抗原反復(fù)刺激后產(chǎn)生的多克隆抗體。卵黃中主要的免疫球蛋白為IgY,其功能與作用類似于哺乳動(dòng)物血清中的IgG。雞lgY的分子量約180k Da,由兩條輕鏈和兩條重鏈組成,分子量分別為60~70k Da和22~30k Da,等電點(diǎn)約為5.2。IgY具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸、抗離子強(qiáng)度和一定的抗酶解能力。

卵黃中的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪,其比例為1:2。大部分蛋白質(zhì)都是脂蛋白,存在于卵黃顆粒中,不溶于水,只有卵黃球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黃球蛋白。因此lgY的分離純化首先需要有效地去除卵黃中的脂類,從水溶性蛋白中分離IgY。目前已建立了諸如PEG、硫酸葡聚糖、天然膠,如海藻酸鈉、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步純化蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)材料

1.健康產(chǎn)蛋雞(最好是SPF雞)、免疫抗原(如雞新城疫滅活疫苗)、弗氏佐劑。
2.滅菌生理鹽水或0.01mol/L pH7.2 PBS、海藻酸鈉、飽和硫酸銨等。
3.毛細(xì)滴管、注射器、碘酊棉、酒精棉、燒杯、玻璃棒、離心管、pH試紙等。
4.微量振蕩器、離心機(jī)、分光光度計(jì)等。

操作方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇:選擇健康、產(chǎn)蛋率高的蛋雞,購(gòu)進(jìn)后飼養(yǎng)1周左右,觀察其健康情況。
2.抗原的準(zhǔn)備:免疫抗原有多種選擇,一般采用滅活的病原體,也可以選擇激素類、蛋白類物質(zhì),使用前可以選用弗氏*佐劑乳化抗原。
3.動(dòng)物免疫:免疫方式主要有口鼻接種、皮內(nèi)接種、皮下接種、肌肉注射、腹腔注射以及靜脈注射。禽類的免疫方式多用肌肉注射,接種中采用胸肌多點(diǎn)注射。使用弗氏*佐劑充分乳化抗原。以商用雞新城疫滅活苗免疫為例,首.次免疫的劑量可以控制在1~2 mL,抗原含量為0.3-0.5 mg/kg(30日齡的蛋雞免疫劑量為0.4 mg/次)2周后進(jìn)行2次免疫,4周后第3次免疫之后每隔1個(gè)月可加強(qiáng)免疫1次。
4.免疫雞血清抗體效價(jià)檢測(cè):一般使用瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫雞血清中的抗體效價(jià)。將免疫蛋雞所用的抗原滴加于抗原孔,免疫雞血清滴加于抗體孔??乖着c抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線者,為陽(yáng)性。最高稀釋倍數(shù)血清孔出現(xiàn)沉淀線,即為該血清的抗體效價(jià)。一般效價(jià)達(dá)到1:64以上時(shí),可開(kāi)始收集免疫蛋雞所產(chǎn)雞蛋。
5.收集卵黃抗體:先用清潔水洗去蛋殼表面的糞污,再使用碘酊和酒精消毒。無(wú)菌條件下打開(kāi)胚殼,傾出蛋黃至滅菌大燒杯中,以1:9的比例加入滅菌生理鹽水或0.01 mol/L pH7.2 PBS稀釋并充分混勻,調(diào)節(jié)pH至5.2,勻漿后的卵黃抗體可以進(jìn)一步提純,也可加入0.01%硫柳汞或每毫升卵黃液加入青.霉素、鏈.霉素各1000單位進(jìn)行防腐抑菌,搖勻后分裝于消毒好的瓶中,冷凍干燥保存或制成干粉利用。

6.IgY的純化:卵黃混合液反復(fù)凍融3次,6000 r/min離心30 min,分離出卵黃蛋白,加入終濃度0.07%的海藻酸鈉和0.02%的NaCl,振蕩,使海藻酸鈉充分溶解,靜置30 min,6000 r/min離心30 min,上清液調(diào)節(jié)pH到7.2,再依次用50%、33%、3%的飽和硫酸銨(pH 7.2)提取IgY,用 SephadexG-25脫鹽。

結(jié)果判定

對(duì)獲得的卵黃抗體進(jìn)行的效價(jià)及活性測(cè)定,可采用免疫電泳實(shí)驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等多種抗體檢測(cè)方法。


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