當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質化嚴重的問題，確認疾病的作用機制并尋找的、有效的、安全的藥物靶點將成為轉化醫(yī)學和創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施，基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。

CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具，因為它易于使用，并且與其他基因調節(jié)工具（例如siRNA技術）相比，脫靶效應更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫，已被廣泛用于靶點識別和機制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時更少，但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點功能分析中提供了更多的技術靈活性。此外，與混合文庫的 CRISPR 方法相比，陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關性通常更加直接。

全基因組CRISPR篩選以識別人肝星狀細胞中TGF-β誘導的肝纖維化的驅動因素

2022年3月11日,Takeda公司的開發(fā)團隊在ACS Chem Biol上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章，為了進一步了解肝纖維化的驅動機制，作者開發(fā)了一個高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺來鑒定肝星狀細胞(HSC)來源的TGF-β誘導的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學表型篩選平臺揭示了TGF-β誘導的肝纖維化的新生物學機制和肝纖維化的潛在藥物靶點。

作者使用ACTA2蛋白表達作為HSC激活的水平，首先確認了HSC對TGF-β的反應，并確認了進行CRISPR/Cas9的轉染條件，包括電脈沖參數，crRNA及tracrRNA濃度，轉染的細胞數，鋪板密度等。

隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進行高通量篩選敲除潛在靶基因，通過計算ACTA2表達的抑制百分比及細胞活率，終從19,027個基因中篩選出了52個基因，其中部分基因為已經被預測可以通過傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物來調節(jié)干預。

為了確認這些基因在改善HSC纖維化方面的作用，作者在HSC中單獨敲除了這些基因，并評估這些基因的缺失對TGF-β誘導的14種生物標志物轉錄譜的影響。

同時，構建器官型肝模型進行共培養(yǎng)，評估纖維化模型中上述基因的表達水平。與GEO profiles數據庫中發(fā)布的公開可用的轉錄組數據進行對比分析。結果進一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發(fā)病過程中對HSC的潛在調控作用。

在對生物標志物轉錄譜影響的實驗中，作者發(fā)現(xiàn)PSMC2的缺失可以抑制多個標志物，并進一步確認小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導的HSC活化。

隨后，作者評估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗中候選基因的表達水平，確認了這些候選基因在HSC中特異性富集。

作者還在UK Biobank上進行了MAGMA分析，確認部分基因的遺傳變異可能會影響NASH和肝纖維化的生物標志物。

作者總結了這些研究的結果并對每個靶基因進行了評分。更高的分數表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標。

總之，作者通過構建肝纖維化的生理模型，通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺從19,027個基因中篩選出52個潛在基因可能在激活的HSC誘導的肝纖維化中起作用，通過一系列的驗證及對比并為10個基因進行評分，這些基因將為開發(fā)下一代肝纖維化療法提供了進一步可能。

當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質化嚴重的問題，確認疾病的作用機制并尋找的、有效的、安全的藥物靶點將成為創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施，基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具，在短時間內完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。

在近幾年的科學研究中，我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選，siRNA篩選以及細菌的CRISPR-Prime編輯的工作中。

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