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引物設(shè)計的原則：
1、引物長度：
一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度。
2、引物的特異性：
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。
3、序列Tm值：
引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度。退火溫度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
4、G+C含量：
有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5、引物的3′端：
引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾；引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高； 引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗
6、引物的5′端：
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
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